PPARα激动剂对2型糖尿病不同发展阶段实验动物模型胰岛β细胞功能的影响及其机理研究

摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体PPARα主要激活与脂肪酸氧化代谢相关基因的表达,其调控作用与代谢性疾病如高脂血症、糖尿病的发生发展密切相关。因此,PPARα激动剂——贝特类药物的主要临床应用是降低血清甘油三酯和升高HDL-C,用于高血脂或2型糖尿病患者脂质代谢紊乱的治疗。近年国内外学者在基础和临床范围对贝特类药物在脂质代谢以外的药理作用做了大量的研究工作,一些研究发现该类药物还能改善血管内皮功能、缓解机体炎症状态,并通过调节脂质代谢增强机体胰岛素敏感性,进而缓解胰岛β细胞的代偿性分泌压力,因而可能具有延缓糖尿病及相关心血管疾病发生发展作用。本实验室在研究调脂类药物对脂质代谢异常、2型糖尿病以及与胰岛素抵抗相关疾病的调节及治疗作用方面有着丰富的实验积累,在一次评价几种PPAR激动剂(包括PPARγ激动剂、PPARα激动剂、PPARα/γ双激动剂)对胰岛素抵抗动物模型胰岛素敏感性影响时发现,PPARα激动剂非诺贝特(fenofibrate)在没有明显改善动物胰岛素敏感性的情况下,使动物血胰岛素水平显著降低。该发现提醒我们PPARα激动剂是否可能对β细胞的胰岛素分泌功能存在直接的影响,从而导致血清胰岛素水平的下降?究竟长期使用PPARα激动剂是有益于还是有损于β细胞的功能?这类药物又是如何导致β细胞功能的变化?由于该类药临床常用于2型糖尿病且伴有高甘油三酯血症患者的长期治疗,因此,考察该类药物对胰岛β细胞功能的影响意义深远、值得深入探讨。
　　 本课题的开展就是建立在这些问题之上,通过大量实验研究证实并解释PPARα激动剂对胰岛β细胞功能产生的影响及其可能作用机制。我们选择两种临床常用的PPARα激动剂非诺贝特和吉非罗齐(gemfibrozil)作为受试药物,用几种处于糖尿病发展不同阶段的实验动物模型,其状态从正常(ICR小鼠)→代谢综合征(MSG肥胖大鼠)→肥胖性胰岛素抵抗的2型糖尿病(高脂喂养C57小鼠),依次加重,甚至包括老年的肥胖性胰岛素抵抗动物模型(14月龄高脂喂养C57小鼠),研究两种PPARα激动剂在糖尿病发展不同阶段中对胰岛β细胞功能的影响,探讨β细胞功能变化的分子机制,并分析这种作用是否依赖于机体所处的状态。以期为PPARα激动剂在临床广泛用于高血脂症、2型糖尿病患者的合理应用提供重要的实验依据。
　　 论文的第一部分在本实验室的设备和技术条件等工作基础上,成功建立了评价胰岛β细胞功能常用两种实验技术及方法--原代胰岛分离培养方法和高葡萄糖钳夹实验技术,另外,也包括用于评价机体胰岛素敏感性的正葡萄糖钳夹实验。可用于体、内外评价和考察胰岛β细胞的胰岛素分泌功能及胰岛的病理生理改变。本部分研究选择正常大、小鼠和几种本实验室常用的2型糖尿病模型动物,确定了高胰岛素-正葡萄糖钳夹和高葡萄糖钳夹的一般步骤及试验参数条件,并考察了该评价方法的稳定性和可靠性；原代胰岛分离及培养方法的建立为今后体外胰岛β细胞功能评价及药物作用机制研究提供较好的实验技术平台。目前,已将这两种方法分别用于抗糖尿病候选化合物的药效学评价及本课题后续的药物作用机制研究。
　　 论文的第二部分着重探讨了非诺贝特(Fen)和吉非罗齐(Gem)对2型糖尿病发展不同阶段动物模型胰岛β细胞功能的影响,包括正常ICR小鼠、代谢综合征动物模型MSG大鼠、2型糖尿病动物模型高脂喂养C57小鼠以及老年高脂喂养C57小鼠模型。研究内容包括两种PPARα激动剂对血脂异常、胰岛素敏感性和胰岛β细胞的胰岛素分泌功能的影响,并进一步探寻药物作用后可能影响p细胞功能的多种相关因素、重要因子发生的改变。在研究中发现,在几种动物模型中Fen和Gem除可以调节血脂紊乱、一定程度上改善胰岛素敏感性外,对正常动物、代谢综合征动物及2型糖尿病动物模型的胰岛素分泌均产生一定负调控作用。而在老年高脂喂养C57小鼠模型中,虽然钳夹实验观察Fen表现出一定程度改善胰岛素分泌的作用,但其血清胰岛素下降幅度与胰岛素敏感性改善的相符关系也并不十分合理,这提示在该模型中Fen对胰岛功能也存在一定的负调控作用。虽然,在几种不同的动物模型中Fen和Gem分别能够不同程度地上调胰腺中糖脂代谢相关因子如GLUT2、GK及PPARα的基因表达,也能一定程度上调胰岛细胞增殖及胰岛素信号通路相关因子如IRS2、PKB、GLP1R的基因表达,甚至对胰岛素生物合成、颗粒囊泡胞吐及离子通道蛋白如PDX1、INS1、SNAP25、Syntaxin1a、NCX1、SERCA2等基因有一定上调作用,并且这些作用均可能利于胰岛β细胞的胰岛素分泌功能。但是,在所有实验模型中也发现一些共同存在的问题是:PPARα激动剂Fen和Gem均能够显著上调胰腺线粒体中解偶联蛋白UCP2的表达,并且不同程度地增加胰腺及胰岛细胞中核因子NF-κB及其上下游炎症因子如TNFα、IL6、iNOS的基因或蛋白表达水平及酶活性。此发现提示贝特类药物可能干扰胰岛细胞中ATP的生成及引发胰腺炎症通路活化,并且这两种作用可能与该类药物导致的胰岛β细胞功能紊乱存在较大的相关性。
　　 论文的第三部分主要选择胰岛瘤细胞株NIT-1,在体外考察了PPARα激动剂Fen对NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响；另外,利用基因工程的方法构建转染Peak-12-NF-κB-GFP报告基因质粒的NIT-1细胞,通过检测绿色荧光蛋白GFP的表达情况考察Fen是否能够活化胰岛β细胞中NF-κB的转录激活?并且通过使用PPARα阻断剂探讨该作用是否是依赖于PPARα的激活?结果显示在Fen10-7M浓度下培养过夜的NIT-1细胞,其高糖刺激的胰岛素分泌水平较正常对照组显著降低,但其影响机制需后续研究证实是否如整体实验所述与UCP2蛋白表达水平有关；而加入PPARα阻断剂MK886(10-6M)共孵育后能够增加被Fen抑制的胰岛素分泌,说明阻断PPARα后能够促进NIT-1细胞高糖刺激的胰岛素分泌。另外发现Fen10-7M浓度培养过夜的NIT-1细胞中GFP表达水平升高,说明Fen有活化NF-κB转录激活的作用,加入MK886拮抗PPARα的激活作用能够一定程度抑制Fen作用后GFP的表达。此结果提示Fen在体外能够活化胰岛β细胞内NF-κB的转录激活作用,抑制高糖刺激的胰岛素分泌,并且其作用可能依赖于PPARα的激活作用。
　　 综上所述,本文首先建立了体内、体外胰岛β细胞功能评价方法。从整体实验动物、体外细胞到分子水平研究了PPARα激动剂类药物对胰岛β细胞功能的影响。最终发现从正常到2型糖尿病发生不同阶段的动物模型中,PPARα激动剂Fen和Gem长期给予能够影响胰岛β细胞的胰岛素分泌功能,该作用与其一定程度活化胰腺中核因子NF-κB通路,上调线粒体ATP合成关键蛋白UCP2的表达有关。依据本课题研究中获得的结果推测,PPARα激动剂导致胰岛β细胞功能紊乱可能通过以下两种方式实现的:第一通过依赖于PPARα激活方式的NF-κB通路的活化,即NF-κB可能属于PPARα这类配体依赖的核受体转录因子调控的下游基因,其活化后诱导下游iNOS的表达,最终导致细胞内氧化、硝化产物增加甚至细胞的凋亡；其二为通过上调线粒体内膜蛋白UCP2的表达,从而干扰胰岛β细胞的线粒体功能及ATP的生成环节。