肿瘤浸润性γδ1T细胞(γδ1TIL)CDR3δ1区的序列分析及TCRγδ1 3δ1结合肿瘤抗原的分子结构研究

摘要

γδT细胞虽然在整个T细胞群体中所占的比例较少,但其作为固有免疫成员在抗感染免疫、肿瘤免疫、免疫调节以及自身免疫等方面的作用日益成为人们关注的热点。然而,较之αβT细胞较为清楚的功能和结构研究,免疫学界对γδT细胞受体(TCRγδ)识别抗原的结构基础所知甚少。而且,与人外周血中γ9δ2TCR识别肿瘤抗原配体及其识别肿瘤抗原的分子机制研究相比,人们对上皮粘膜中的Vδ1的研究明显不足。
　　 近年来,本实验室系统深入地研究了γ9δ2T细胞识别的肿瘤抗原配体及其识别的分子机制,并取得了一些重要的学术成果。前期结果显示,CDR382的侧翼序列在TCRγ9δ2与肿瘤抗原结合中起关键作用[1]。
　　 本论文旨在进一步探讨γδT细胞中另一大类上皮内γδ1T细胞在肿瘤免疫中的作用及其识别肿瘤抗原的分子机制。
　　 本实验第一部分工作为肿瘤浸润性γδ1T细胞(γδ1TIL)CDR381区的序列分析。
　　 首先用固相包被抗体,体外扩增了14例肿瘤组织(胃癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、嗜铬细胞瘤)和2例肿瘤腹水(浆乳癌)的γδ肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltration lymphocytes,γδTIL),培养3～4周后,γδTIL呈优势生长(最高达98％),主要为δ1亚型。
　　 RT-PCR法扩增CDR381基因片段,测序分析其序列特征。结果发现,CDR3δ1区序列有以下特征:一是γδTIL TCR CDR3δ1确实存在优势序列；二是不同个体的同种组织来源的γδTIL的CDR3δ1优势序列趋于相同,但也存在差异；三是不同组织来源的γδTIL的CDR3δ1优势序列不同；四是不同个体的同种组织来源的γδTIL,的CDR381优势序列相对较短。以上结果说明,识别相同组织来源肿瘤的γδTIL的CDR3δ1序列具有有限多样性,提示相同组织来源的肿瘤的表面抗原也可能具有有限多样性。因此,我们选取3例胃癌组织共有的CDR3δ1优势序列(GTM)作为后续有关结构研究的基础。
　　 利用人工合成的CDR3δ1(GTM)肽作为探针,Western blot检测胃癌细胞系BGC-823总蛋白中的结合分子,发现在66～90KD和90KD以上分别有一条染色带。提示BGC-823总蛋白中可能存在CDR3δ1识别的蛋白分子。但以GTM肽-亲和柱层析分离BGC-823总蛋白,未能成功获得结合蛋白分子。
　　 体外扩增γδTIL的表型研究结果显示,γδTIL高表达NKG2D、CD8、GranzymeA和TLR8,低表达或不表达CD4、GITR、CTLA-4和CD127。一例胃癌W2-γδTIL和一例肾癌S2-γδTIL杀伤实验结果显示,W2-γδTIL和S2-γδTIL均对肿瘤细胞具有较强的杀伤功能。检测γδTIL分泌的细胞因子,结果显示所有TIL的IL6分泌水平均较高；γδ1TIL的GM-CSF因子分泌水平明显高于αβTIL。
　　 本实验的第二部分工作是探讨CDR381各个结构域在抗原识别中的作用。主要通过CDR361合成多肽、CDR381移植性TCR以及细胞膜表达不同CDR381移植型TCRγδ异质二聚体的技术体系,来研究CDR3δ1与抗原特异性结合的分子结构基础。
　　 人工合成CDR3δ1(GTM)肽及其V、D、J区分别随机突变肽GTM-Vm、GTM-Dm、GTM-Jm,通过流式细胞术、激光共聚焦扫描显微镜、ELISA、SPR及免疫组化等方法,检测GTM肽及其突变肽与肿瘤细胞或组织的结合。结果显示,与GTM肽相比,GTM-Vm和GTM-Jm肽的结合活性明显下降,而GTM-Dm肽的结合活性变化不大,提示保守的CDR3δ1侧翼序列在抗原识别中起关键作用。
　　 进而,通过重组CDR361移植的TCRγ4-Fc/δ1-Fc融合蛋白即γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM)-Fc及其三种突变体融合蛋白γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Vm)-Fc、γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Dm)-Fc和γ4-Fc/δ1-CDR3(GTM-Jm)-Fc检测与肿瘤细胞或组织的结合作用。结果与合成肽所得结果一致。进一步证明TCRγ481与肿瘤抗原的相互作用主要取决于其保守的侧翼序列。
　　 最后,我们将完整的γ4和δ1链转染进J.RT3-T3.5细胞,建立膜表达不同CDR381移植型TCR异质二聚体的细胞,以期在细胞水平上模拟γδ1TIL识别肿瘤的分子机制,检测CDR381区不同结构域在肿瘤抗原识别中的作用。结果在转染81-CDR3(GTM)-γ4和δ1-CDR3(GTM-Dm)-γ4的细胞表面用FACS检测到了γδTCR的表达；但在转染突变体序列的δ1-CDR3(GTM-Vm)-γ4和δ1-CDR3(GTM-Jm)-γ4的细胞表面未见γδTCR的表达。即使改变CDR3区各区突变氨基酸(将随机突变氨基酸换成丙氨酸),δ1-CDR3(GTM-VAm)-γ4和δ1-CDR3(GTM-JAm)-γ4仍未在转染细胞膜表达。转染细胞的功能实验正在进行中。
　　 综上所述,我们得出以下结论:
　　 1、优化体外肿瘤浸润性γδT细胞(γδTIL)的扩增培养条件,成功培养16例γδTIL,主要为δ1表型。在体外,扩增所获γδ1TIL对肿瘤细胞具有杀伤活性。
　　 2、体外扩增培养的γδTIL的TCR CDR3δ1序列具有相对优势特征。不同个体的同种组织来源的γδTIL的CDR3区优势序列趋于相同。选取3例胃癌来源γδTIL共有的CDR3δ1区优势序列GTM作为后续结构研究的基础。
　　 3、采用随机突变的策略,在CDR351短肽水平上、γ4δ1T-Fc融合蛋白水平上,证明CDR3δ1的侧翼序列(V、J区)是γδ1TCR识别肿瘤的关键区域。
　　 4、通过Lentivirus表达系统建立了在J.RT3-T3.5表面表达TCRγ4δ1的平台,以期在细胞水平上模拟γδ1TIL进而研究其识别肿瘤的分子机制。转染细胞的功能实验正在进行中。