RIP1在UVB引起成纤维细胞损伤中作用机制的研究

摘要

受体相互作用蛋白(RIP)是一种重要的细胞信号转导分子。最近,国际上3个独立研究均发现RIP是细胞生存和死亡的重要交叉点,在细胞的凋亡与存活、细胞的程序性坏死等过程中发挥着关键性的作用。其中,RIP1是RIP家族中的重要蛋白。本课题组在前期工作中通过双向电泳结合质谱鉴定技术首次发现小剂量中波紫外线照射人皮肤成纤维细胞后,细胞内RIP1的表达明显升高,并用RT-PRC和WesternBlot的方法证实了这一结果,但RIP1在中波紫外线照射成纤维细胞中的作用研究目前尚无报道。
　　 目的:
　　 建立RIP1基因沉默的成纤维细胞模型,并确定基因沉默持续时间；通过研究RIP1与紫外线照射引起的凋亡、氧化损伤和基质金属蛋白酶的关系,揭示RIP1在紫外线照射成纤维细胞的作用,更全面的认识紫外线损伤成纤维细胞的机制,发现其中重要的蛋白,为治疗和预防光线性皮肤疾病提供实验依据和理论基础。
　　 方法:
　　 1.选择合适的LWB照射剂量和观测时间。
　　 1)细胞悬液法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,并用细胞免疫荧光及PCR的方法鉴定成纤维细胞。
　　 2)噻唑蓝(MTT)比色法比较不同剂量UVB照射成纤维细胞后不同时间点细胞活力的变化。
　　 2.用RT-qPCR的方法选择适合本实验的内参基因。
　　 3.RNA干扰的方法进行NIH3T3细胞RIP1基因转录后沉默,并用RT-qPCR和Western Blot进行干扰效果及干扰持续时间的鉴定。
　　 4.UVB照射RIP1干扰的NIH3T3细胞,进行以下实验:
　　 1)RT-qPCR、Western Blot检测细胞产生MMP mRNA和蛋白水平的变化。
　　 2)Hoechst染色法观察细胞的形态学变化。
　　 3)流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化.
　　 4)流式细胞术及比色法检测细胞内Caspase-8及-3活性的变化。
　　 5)荧光显微镜及流式细胞术检测细胞内ROS活性的变化。
　　 结果:
　　 (1)包皮组织胰酶消化后,用细胞悬液法成功获得了高纯度的人皮肤原代成纤维细胞。
　　 (2)剂量25-100 mJ/cm2UVB照射原代成纤维细胞24h后,细胞活性明显下降,随着时间的延长,细胞活性的下降更为明显；剂量为20 mJ/cm2UVB照射原代成纤维细胞48h后,细胞活性明显下降,确定实验用UVB剂量。
　　 (3)ACTB、TUBB1更适合在UVB照射成纤维细胞实验中作为基因表达研究的内参基因,而TUBA1A及VIM不能作为此类实验的内参基因。
　　 (4)成功建立了RIP1干扰的NIH3T3成纤维细胞,且干扰持续时间超过96h。
　　 (5)UVB照射经RIPl干扰的NIH3T3细胞24h后,细胞内MMP-1、MMP-3 mRNA的表达水平明显升高,24h后MMP-1蛋白水平的表达也明显升高。
　　 (6)UVB照射经RIP1干扰的NIH3T3细胞24h后,细胞出现凋亡形态,细胞凋亡率升高,且Caspase-8及-3的活性均明显升高。
　　 (7)UVB照射经RIP1干扰的NIH3T3细胞12h后,细胞内活性氧的活性明显下降。
　　 结论:
　　 1、应根据具体实验条件,选择适合本实验条件的内参基因。
　　 2、RIPl可抑制UVB照射成纤维细胞引起的MMP产生。
　　 3、RIP1可抑制UVB照射成纤维细胞所诱导的细胞凋亡过程。
　　 4、RIP1很可能是UVB照射成纤维细胞引起ROS产生的重要信号转导分子。