诱导骨髓间充质干细胞软骨定向分化的关键因子筛选及体外诱导方案优化

摘要

软骨组织损伤后的自我修复能力极低,是临床难治疾病之一。软骨组织工程为软骨组织缺损修复提供了新的途径。骨髓间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)因其取材方便,体外扩增能力强及具有软骨分化潜能,已逐渐成为软骨组织工程的重要种子细胞来源之一。但是现有的诱导BMSCs向软骨分化的方法存在诱导效率低,效果不稳定,非生理性诱导等缺点,寻找更加有效的诱导方法势在必行。
　　 已有研究发现关节微环境能够促进BMSCs软骨分化。软骨细胞是软骨组织中的唯一细胞类型,是关节微环境内最主要成分。课题组在前期研究中通过软骨细胞与BMSCs混合共培养证实了软骨细胞能够部分模拟关节内的软骨微环境诱导BMSCs软骨分化,并进一步建立了软骨细胞.材料复合物和BMSCs-材料复合物的隔离共培养体系,证实软骨细胞-材料复合物分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs向软骨细胞分化。
　　 本课题中,我们设想从软骨细胞分泌的可溶性因子中筛选有诱导作用的关键因子,从而指导我们建立成分明确,效果稳定的诱导方法。然而,可溶性因子成分种类繁多,一一进行分析是不现实的,我们需要一种大容量,多因素的分析方法。蛋白质组学是对蛋白质进行大规模研究的一门科学,具有大规模,高通量等优点,可用于研究极其复杂的多种细胞因子和蛋白质的变化。与之相互补的蛋白质芯片技术是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法,是一种高通量,灵敏度更高且具有高度准确性的研究方法,能在一次实验中提供相当大的信息量,使我们能够全面、准确的研究蛋白表达谱,这是传统的蛋白研究方法无法做到的。现在这两种技术已逐渐成为干细胞和组织工程领域的重要研究方法。因此,我们考虑通过差异蛋白质组学和蛋白质芯片技术从软骨细胞分泌的可溶性因子中筛选有主要诱导作用的因子。
　　 通过差异蛋白质组或蛋白芯片筛选有诱导作用的因子,我们要解决的第一个关键问题是必须要找到合适的比较对象,两者差异太大势必增加分析时的难度和工作量；两者差异太小,可能会遗漏一些重要因子。我们设想软骨细胞-材料复合物在形成组织工程化软骨和成熟过程类似于体内软骨形成过程,在这一过程中所分泌因子在不同时期的组成成分和含量是不一样的:软骨细胞-材料复合物在组织形成过程中分泌的因子是软骨形成过程中所需的,更能有效诱导BMSCs软骨分化；而后期的软骨细胞-材料复合物已基本形成了软骨组织,分泌的因子种类和剂量可能以维持软骨形态为主,而非诱导分化为主的因子。因此,我们设想首先对不同时期的软骨细胞-材料复合物的诱导作用进行系统的比较,从而为差异蛋白质组和蛋白质芯片实验确定合适的比较样本,为后续实验奠定基础。
　　 进行差异蛋白质组或蛋白芯片实验的另一个关键问题是无血清培养基的建立。血清中的高丰度蛋白会影响蛋白实验结果,但是,直接去除血清会影响软骨细胞体外培养过程中的存活、增殖、软骨表型的维持,以及软骨组织的构建。因此,我们实验中需要建立一种良好的无血清培养基,既能维持软骨细胞的正常表型和软骨组织形成,又不会干扰蛋白质组和蛋白芯片的实验结果。我们根据文献报道和初步的实验筛选,选取了能够促进软骨细胞存活和增殖,有利于软骨细胞表型保持和细胞外基质分泌的因子和非蛋白物质,如胰岛素铁硒传递蛋白,地塞米松和维生素C。然后,研究了它们作为无血清培养基主要成分对软骨细胞表型维持和软骨组织构建的影响,并最终建立了符合实验需要的无血清培养基。
　　 通过上述两个关键问题的解决,为我们后续实验奠定了基础。我们应用高通量的差异蛋白质组学技术和蛋白质芯片技术,对具有不同诱导能力的软骨细胞-材料复合物分泌的可溶性因子作比较,找到差异蛋白,初步筛选了可能具有软骨诱导作用的关键因子,期望能有利于建立成分明确,效果稳定的诱导方法,为软骨组织工程向临床应用转化提供理论和技术支持。
　　 研究目的:将组织工程技术与蛋白质芯片和差异蛋白质组学相结合,从软骨细胞分泌的可溶性因子中筛选关键的软骨诱导因子,以期帮助建立成分明确,效果稳定的诱导方法,为以BMSCs为种子细胞的软骨组织工程应用于临床奠定理论基础,提供技术支持。
　　 方法和结果:
　　 1不同时期软骨细胞-材料复合物诱导作用的比较
　　 方法建立隔离共培养体系,通过软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物的隔离共培养,观察和比较软骨细胞接种支架材料3天后(3d组),2周后(2w组)和8周后(8w组)开始的隔离共培养中软骨细胞-材料复合物分泌的可溶性因子对BMSCs成软骨诱导作用的差异。
　　 结果3d组BMSCs-材料复合物形成了较均匀的软骨样组织,组织学呈现典型的软骨陷窝结构；2w组仅在周边部形成了典型的软骨样结构,内部则为纤维状成分；晚期8周组则收缩变形,仅形成了纤维样结构。
　　 结论软骨细胞分泌的可溶性因子能够诱导BMSCs成软骨分化,而且早期软骨细胞-材料复合物的分泌液对BMSCs的成软骨诱导作用明显强于晚期分泌液的诱导作用。
　　 2无血清培养基的建立
　　 方法培养猪耳软骨细胞,分为无血清组和含血清组,无血清组应用包含胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基,含血清组应用包含10％血清的常规培养基,观察了平面和三维培养状态下无血清培养基对软骨细胞增殖,基质分泌和软骨形成的作用。
　　 结果平面培养条件下,无血清培养组的细胞增殖率出现轻度下调,但在三维培养情况下可以保持软骨细胞存活和软骨细胞的表型,在二型胶原和蛋白多糖染色方面与含血清组相当,软骨特异基因ColⅡ,Aggrecan的表达与含血清组无明显差异,并能够形成较好的软骨样组织。
　　 结论以ITS,地塞米松及维生素C为主要成分建立的无血清培养基在三维培养条件下能基本保持软骨细胞的存活和表型,能用于软骨细胞的体外三维培养。
　　 3软骨细胞-材料复合物分泌的可溶性因子中具有软骨诱导作用因子的初步筛选
　　 方法培养人肋软骨来源软骨细胞,藻酸盐凝胶包埋,接种PGA/PLA材料后,体外培养3天后开始交替无血清和含血清培养,交替时间为3天,取无血清培养的上清作样本,将培养2周内的上清样本作为早期组,将培养8周-10周的上清样本作为晚期组,两组样本经过差异蛋白质组和蛋白质芯片初步筛选差异蛋白,并从基因水平和蛋白水平证实其表达差异。初步将所筛选蛋白IGFBP-4,6用于诱导成分,观察其对BMSCs成软骨的诱导作用。
　　 结果:差异蛋白组学发现早期和晚期有52个差异点(差异大于2倍),选取其中30个点进行质谱分析,鉴定出蛋白13个,其中具有软骨诱导作用的蛋白因子还在进一步筛选证实中。蛋白质芯片技术发现软骨细胞早期分泌较晚期有6个因子高表达(差异大于2倍),包括胰岛素样生长因子结合蛋白2,4和6(IGFBP-2,4,6)和成纤维细胞生长因子2,6(FGF-2,6),将IGFBP-4,6作为候选因子,通过ELISA实验和PCR检测从蛋白水平和基因水平证实这两个因子在早期和晚期的软骨细胞-材料复合物分泌液和组织中的表达差异。
　　 结论:蛋白质芯片技术发现IGFBP-4,6等6个生长因子类蛋白在早期高表达,差异蛋白组学发现52个差异点,具有软骨诱导作用的蛋白因子需要进一步筛选。
　　 4 IGFBP-4,6诱导BMSCs成软骨分化的作用研究
　　 方法:将IGFBP-4,6作为诱导成分单独(IGFBP4,6单独诱导组)应用或添加于BMSCs常规成软骨诱导液中(联合诱导组),观察IGFBP-4,6诱导BMSCs成软骨情况,对照组1应用含有转化生长因子β1(TGFβ-1)的常规成软骨诱导液,对照组2应用未添加TGFβ-1的基本软骨诱导液。在20天分别取材行大体观察,HE,甲苯胺蓝染色和二型胶原免疫组化染色,半定量PCR方法检测成软骨相关基因的表达变化。
　　 结果:诱导第20天可在对照组1和联合诱导组的pellets周边部看到软骨陷窝的形成,甲苯胺蓝染色和二型胶原免疫组化染色更阳性,主要分布在pellets的外周。对照组2和IGFBP4,6单独诱导组未见软骨样组织形成。PCR结果显示,软骨特异基因二型胶原(ColⅡ)和核心蛋白(Aggrecan)在四组均有阳性表达,其中联合诱导组和对照组1的表达明显的强于另外两组,Aggrecan的表达在联合诱导组强于对照组1；Sox9仅在阳性对联合诱导组和对照组1表达,联合诱导组明显强于阳性对照组。
　　 结论:100ng/ml IGFBP-4和100ng/m6尚不能单独诱导BMSCs成软骨分化,但是可能与TGFβ-1协同作用促进TGFβ-1的成软骨诱导作用。
　　 综上所述,本研究将组织工程技术与差异蛋白质组学相结合,从一个全新的,系统的角度来研究软骨细胞分泌的可溶性因子,筛选其中有主要诱导作用的因子,为建立良好的诱导方法提供了依据,具有重要的科学意义和研究价值。而且筛选出有主要诱导作用的因子,可以指导我们建立成分明确,效果稳定的诱导方法,为以BMSCs为种子细胞的软骨组织工程应用于临床奠定基础,提供技术支持。