C反应蛋白、血管生成素2遗传变异及其血浆浓度在脑卒中发病风险及复发中的作用研究

摘要

第一部分：C反应蛋白变异及其血清水平与脑卒中发病风险及复发中的作用研究
　　 研究背景：
　　 脑卒中是一种由环境因素及遗传因素共同作用造成的复杂性疾病，是国人重大的健康负担。脑卒中一旦发生，死亡率极高，而且存活后的残废率高达70％，脑卒中复发率也非常高,3年和5年的复发率分别为28%和51%。目前中国约有600万脑卒中残存者，每年新发病例150万，而且发病逐渐年轻化。
　　 脑卒中是一个症候群，包括缺血性脑卒中（动脉硬化血栓及栓塞）、出血性脑卒中（高血压动脉硬化性血管病变及血管畸形，动脉瘤）。脑卒中的发病机制十分复杂，动脉粥样硬化是其最主要的病理基础之一。目前认为动脉粥样硬化是复杂的血管性疾病，是血管对损伤的慢性炎症反应。C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)作为系统性炎症的标志物，被认为在炎症反应中起着关键作用。血清CRP水平可以反映机体潜在的炎症活跃程度，并与脑卒中、冠心病等动脉硬化性疾病密切相关。
　　 无论是在机制研究还是观察性流行病学研究中，CRP在心脑血管发病中的作用，目前存在争议。一种观点倾向认为CRP直接参与、介导炎症反应并在心脑血管病的发生中起重要的作用。另一种观点认为CRP与心脑血管病的发生之间无直接的因果关系，CRP升高仅反映了动脉粥样硬化血管非特异性炎症反应的程度，CRP并未直接参与动脉硬化的发生、发展。
　　 本研究拟通过多中心病例对照关联研究探讨可影响血清CRP水平的CRP遗传变异和单体型与脑卒中易感性的关系；通过前瞻性研究探讨可影响血清CRP水平的CRP遗传变异和单体型与脑卒中复发的关系。
　　 研究目的：
　　 本研究拟揭示CRP遗传变异和单体型是否为脑卒中易感性和复发的遗传危险因素；
　　 研究方法：
　　 本研究采用病例对照研究，探讨可影响CRP水平的CRP的遗传变异与脑卒中易感性的关系；采用前瞻性研究，探讨可影响CRP水平的CRP的遗传变异与脑卒中复发的关系。研究对象包括1572例脑卒中病例（694例脑梗塞,437例腔隙性脑梗塞,441例脑出血）及1485例对照，来自中国的7个临床中心。与CRP水平相关的CRP遗传变异rs1205及rs2808630用限制性片段长度多态性法（RFLP）进行基因分型。血清CRP水平采用ELISA方法检测。对入选病例进行4.5年（中位数）随访，采用多元回归分析、Kaplan-Meier分析及Cox回归模型分析血清CRP水平及与CRP血清水平升高相关的CRP遗传变异与脑卒中的易感性和复发的关系。
　　 研究结果：
　　 1．无论是病例组总体还是脑卒中三个亚型中，血清CRP水平显著高于对照组。血清CRP水平分别为[中位数（全距）]：对照组0.7100(9.96)mg/L，脑卒中总体1.0113(9.97)mg/L(三个亚型分别为：脑梗0.9784(9.85)mg/L、腔梗1.0094(9.97)mg/L、脑出血1.0381(9.95)mg/L)，P＜0.01。
　　 2．校正了年龄、性别、体重指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、HDL-C、糖尿病及吸烟等传统心血管病危险因素后，无论是在病例组还是对照组，rs1205A及rs2808630G等位基因携带者，其血清CRP水平显著升高。rs1205基因型GG、GA及AA血清CRP水平[中位数（全距），mg/L]在病例组分别为：0.8106(7.76)，1.0113(9.96)，1.4400(9.84)，P＜0.001；对照组分别为：0.6294(9.95)，0.7144(9.05)，1.0100(9.28)，P＜0.001；rs2808630基因型AA、AG及GG血清CRP水平[中位数（全距），mg/L]在病例组分别为：0.9109(9.97)，1.0769(9.71），1.8713(9.61)，P＜0.001；对照组分别为：0.6875(9.96)，0.7119(9.39),3.6891(9.06)，P=0.004。
　　 3．在校正了传统心血管病危险因素后，无论是显性模式、隐形模式还是加性模式下，CRP基因多态rs1205G/A、rs2808630A/G与脑卒中或脑卒中任一亚型无显著相关；rs1205(GA＋AAvsGG)校正后的优势比（95%可信区间）分别为：脑卒中总体：0.97(0.81-1.15)，脑梗组：1.01(0.81-1.26)，腔梗组：1.00(0.78-1.27)，脑出血组：1.01(0.77-1.34)。rs2808630(AG＋GGvsAA)校正后的优势比（95%可信区间）分别为：脑卒中总体：0.96（0.80-1.15），脑梗组：0.85(0.67-1.07)，腔梗组:1.14(0.89-1.47)，脑出血组0.94(0.71-1.26)。
　　 4．在所有3个频率>5%的单体型(rs1205/rs2808630:GA、AA、AG)中，未发现单体型频率与脑卒中或脑卒中任一亚型显著相关，也未发现单体型频率与脑卒中复发相关。
　　 5．校正了年龄、性别、体重指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、HDL-C、糖尿病及吸烟等传统心血管病危险因素后，rs1205G/A(相对危险度RR(95%CI)1.039(0.816-1.324)P=0.755)及rs2808630A/G(相对危险度RR(95%CI)1.094(0.853-1.403)P=0.479)与脑卒中复发仍为无显著相关。
　　 结论：
　　 CRP基因变异与CRP血清水平显著相关。CRP基因变异及单体型不是脑卒中发生及复发的遗传危险因素；CRP水平在脑卒中病例组显著升高，是脑卒中的标志物，但我们推测CRP不是脑卒中的致病因素。以CRP作为脑卒中发病及复发的预警指标应慎重考虑。
　　 第二部分：血管生成素2启动子区变异及其血浆水平与脑卒中发病及复发的关系研究
　　 研究背景：
　　 脑卒中是一种由环境因素及遗传因素共同作用造成的复杂性疾病，是国人重大的健康负担。脑卒中的病理过程包括动脉粥样硬化、血管炎症、血管渗透性改变等，其发病机制远未阐明。许多报道表明血管生成素(Angiopoeitin，Ang)及其受体酪氨酸激酶Tie2信号系统参与了许多与脑卒中密切相关的病理过程，不仅调控血管发生，而且参与调控内皮细胞炎症反应。血管生成素1(Angiopoietin 1，Ang1)与血管生成素2（Angiopoietin 2，Ang2）均为受体酪氨酸激酶Tie2(tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain 2)的天然配体，与Tie2相互作用。Ang2和Ang1互为天然拮抗剂，Ang2特异结合于血管内皮Tie2受体后，并不引起受体的磷酸化，通过竞争性地抑制Ang1与Tie2受体结合，从而抑制Tie2磷酸化，起到破坏血管稳定，促使血管结构松解，解除血管周围细胞、细胞外基质对内皮的抑制作用。因此，Ang2祓认为是Ang-Tie2系统的动态调节者，维持血管生长、退化的动态平衡。
　　 Ang2还参与调控炎症反应，在血管快速应答过程中与TNFα协同作用，促进TNFα诱导的炎症相关因子的表达，如ICAM1，VCAM1等。临床研究表明，Ang2在急性冠脉综合征及高血压患者中表达上调，而急性冠脉综合征及高血压均为脑卒中的危险因素。尽管目前尚不能明确Ang2水平增加是急性冠脉综合征及高血压的原因还是结果，但Ang2已被认为是高血压患者心血管病（心肌梗死、脑卒中和死亡）风险的生物标志物。
　　 考虑到Ang2在动脉粥样硬化、血管炎症反应及血管渗透性改变等病理、生理过程中发挥作用，这些过程与脑卒中的发生发展密切相关，我们提出假设：血浆Ang2水平及/或ANGPT2（编码Ang2的基因）的遗传变异与脑卒中的易感性和复发相关联。
　　 研究目的：
　　 本研究拟揭示ANGPT2遗传变异和单体型是否为脑卒中易感性和复发的遗传危险因素；血浆Ang2水平是否可以作为脑卒中易感性和复发的独立预测因子。
　　 研究方法：
　　 本研究采用病例对照研究，探讨血浆Ang2水平及ANGPT2的遗传变异与脑卒中的易感性的关系；采用前瞻性研究，探讨血浆Ang2水平及ANGPT2的遗传变异与脑卒中复发的关系。研究对象包括1513例脑卒中病例（674例脑梗塞,419例腔隙性脑梗塞,420例脑出血）及1582例对照，来自中国的7个临床中心。采用限制性片段长度多态性法（RFLP）对ANGPT2启动子区所有tagSNP（rs3739390，rs2515507及rs3739391）进行基因分型。前瞻性研究中，1735例脑卒中患者（794例脑梗塞,475例腔隙性脑梗塞,466例脑出血）采用ELISA方法检测血浆Ang2水平并进行4.5年（中位数）随访，采用多元回归分析、Kaplan-Meier分析及Cox回归模型分析血浆Ang2水平及ANGPT2的遗传变异与脑卒中的易感性和复发的关系。Haploview软件来计算遗传标记之间的连锁不平衡程度。为了研究其潜在的机制，本研究进一步运用荧光素酶报告系统研究ANGPT2基因启动子区变异对转录活性的影响。
　　 研究结果：
　　 1．校正了年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒等传统危险因素后，ANGPT2+442C等位基因携带者与野生型G等位基因携带者相比，腔梗易感性增加(显性模式：优势比(OR)1.42，95%可信区间(95%CI)(1.08-1.87)。在Bonferronicorrection校正后，ANGPT2+442C仍与腔梗易感性相关(P=0.012)；荧光素酶报告系统显示，ANGPT2+442C基因型转录活性为+442G转录活性2.10倍(P=0.014)。
　　 2．血浆Ang2水平与腔梗复发相关联，校正了传统危险因素后，与Ang2水平最低四分位相比，第二四分位危险比(hazardratio，HR)(95%CI)为1.48(0.74-2.95)，第三四分位危险比(95%CI)2.56(1.35-4.86)，第四四分位(危险比(95%CI)为2.15(1.11-4.17)。进一步校正ANGPT2启动子区多态(+442G/C、-220G/A、+398C/T)，仍显示血浆Ang2水平增加与腔梗复发相关。
　　 3．ANGPT2基因启动子区+398C/T变异与血浆Ang2水平相关联，校正了年龄、性别、体重指数、吸烟、饮酒等传统危险因素后，+398T等位基因携带者(n=126)，其血浆Ang2水平（平均浓度为4.26ng/ml，浓度范围：0.13-59.44ng/ml）高于+398C等位基因携带者（n=234，平均浓度为3.95ng/ml，浓度范围：0.12-49.41ng/ml，P=0.033）。
　　 4．ANGPT2启动子区+398C/T变异与腔梗复发相关，与脑梗及脑出血复发无关。与+398C相比，+398T腔梗复发危险比(95%CI)为1.67(1.06-2.63);进一步校正血浆Ang2水平后，仍有显著关联。
　　 5．ANGPT2基因单体型G-G-T(-220/+442/+398)可增加脑梗(OR=1.54，95%CI1.15-2.08)和脑出血(OR=1.64，95%CI1.17-2.32)的发病风险；而携带+442C等位基因的单体型G-C-C(-220/+442/+398），与脑梗(OR=1.84，95%CI1.18-2.87)、腔梗(OR=2.16，95%CI1.30-3.57)和脑出血(OR=2.10，95%CI1.27-3.46)发病风险显著相关。
　　 结论：
　　 本研究提示ANGPT2启动子区变异及单体型与脑卒中发病风险相关；血浆Ang2水平及其启动子区基因多态可能是预测脑卒中（特别是腔隙性脑梗塞）复发的新的生物标志物；Ang2可能在脑血管疾病的发生发展中起到重要的调节作用，并可成为脑血管病新的诊治靶点。

目录

缩略词表

第一部分 C反应蛋白变异及其血清水平在脑卒中发病风险及复发中的作用研究

前言

研究对象和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 血管生成素2启动子区变异及其血浆水平在脑卒中发病及复发中的作用研究

前言

研究对象和方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

致谢

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