骨架蛋白IQGAP1与AurorA-A激酶相互作用并增强其蛋白稳定性

摘要

IQGAP1是一种进化保守的多结构域蛋白，它是到目前为止IQGAP(IQ-domainGTPase-activatingprotein)蛋白家族三个成员IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3中被研究的最多也是最深入的一员，IQGAP1于1994年首次被克隆出。其独特的分子结构赋予了IQGAP1多种功能，从而使其成为细胞黏附、细胞迁移、细胞外信号转导及细胞分裂等多种功能活动的重要调控分子。研究发现，许多人类组织中都能检测到骨架蛋白IQGAP1的表达。在细胞中，IQGAP1能通过与多种细胞信号通路中重要蛋白分子相互作用，这些相互作用使得IQGAP1能够参与调控许多细胞内及细胞外事件。目前越来越多的研究发现，IQGAP1在肿瘤的发生发展中扮演着越来越重要的角色。因此，IQGAP1对肿瘤的研究具有十分重要的意义。
　　 本研究中，我们在肿瘤细胞内发现了一个新的可以与IQGAP1相结合的蛋白分子-Aurora-A。Aurora-A定位于人类染色体20q13，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族-Aurora家族的成员之一，到目前为止该蛋白激酶家族共分为三类：Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C.Aurora丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族在中心体成熟、分离，双极纺锤体组装，染色体分离和胞质分裂过程中都发挥重要作用。Aurora-A作为一个重要的癌基因，其编码的蛋白在多种人类肿瘤中都存在过表达的现象，如结肠癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌以及食管癌等。我们验通过体外实验研究发现，GST-Aurora-A融合蛋白可以结合细胞内源性IQGAP1蛋白。同时免疫共沉淀实验也发现在HeLa细胞中，内源性Aurora-A与IQGAP1蛋白也可以相互作用。在乳腺癌MCF-7细胞中瞬时过表达IQGAP1可以引起Aurora-A蛋白水平的增高和激酶活性的增加。进一步的研究还发现，在IQGAP1过表达的细胞中，Aurora-A蛋白的半衰期延长、稳定性增加、其与后期促进复合体(theanaphasepromotingcomplex/cyclosome)中的各个组成蛋白(APC2、CDC27和CDH1)之间的相互作用也明显减弱。与此同时瞬时特异性敲降MCF-7细胞内源性IQGAP1的表达可以有效的降低细胞内Aurora-A的蛋白水平。但是通过逆转录PCR以及实时荧光定量PCR实验研究发现，特异性敲降细胞内IQGAP1并不能引起Aurora-AmRNA水平的变化。这一结果提示，IQGAP1对Aurora-A的调控主要体现在转录后水平。由于过表达IQGAP1可以增强肿瘤细胞的增殖能力，因此本实验利用Aurora-AsiRNA特异性敲降IQGAP1过表达MCF-7细胞中内源性Aurora-A发现，Aurora-AsiRNA可以有效的抑制由IQGAP1过表达引起的细胞增殖。此结果提示我们，IQGAP1有可能通过影响细胞内Aurora-A的水平和活性，参与调控肿瘤细胞的增殖。
　　 综上所述，IQGAP1可以通过调节细胞内Aurora-A的蛋白稳定性及激酶活性，参与细胞增殖，从而影响肿瘤的发生发展。
　　 真核细胞中细胞分裂周期是一个严格调控、高度有序的过程，细胞的有丝分裂对肿瘤细胞的扩增起着关键的调节作用，有丝分裂的偏差会导致基因组不稳定，从而引发肿瘤。Aurora激酶家族又被称作极光激酶家族，是一组调控细胞有丝分裂的丝/苏氨酸蛋白激酶，包括三个成员：AuroraA、B、C。在低等生物（酵母）在进化早期就独立出来，因此它们仅有一个Aurora基因。较高等的动物细胞由于基因复制的结果，它们有Aurora-A和Aurora-B两个同源基因。脊椎动物的Aurora-A和Aurora-B可能来自于无脊椎动物的Aurora-A复制后的独立进化。哺乳动物Aurora-B在进化中可能发生了重组或复制，衍生出Aurora-C。Aurora激酶三亚群在结构上具有高度保守性，其蛋白质的一级结构含有两个结构域，C末端结构即催化区和N末端即可变区，其中人类Aurora-A和Aurora-B催化区的氨基酸序列保守性达到71％，然而它们三者的N末端即可变区却不相同。这种催化区结构的保守性表明Aurora激酶的底物在结构上具有特异性，而且催化区的晶体结构也已完全揭示，为研究其特异性底物和调控物提供了条件。Aurora-A蛋白激酶在中心体复制、两极纺锤体的形成、染色体的重排和染色体检查点的监测等重要的有丝分裂事件中发挥着至关重要的作用。本文就近年来有关Aurora-A蛋白激酶的研究进展进行综述。

目录

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缩略语表

前言

1.骨架蛋白的功能

1.1.结合信号通路中的蛋白

1.2.细胞内信号分子的定位

1.3.协调正负反馈

1.4.激活处于非激活状态的信号分子

2.IQGAP1功能简介

2.1.IQGAP1表达和定位改变影响癌症预后

2.2.IQGAP1参与的信号通路

2.3.IQGAP1与细胞增值与粘附

2.4.IQGAP1与细胞侵袭和迁移

2.5.IQGAP1与血管生成

3.本文研究目标

材料与方法

1.实验材料

1.1.菌种、质粒和细胞株

1.2.主要试剂

1.3.引物合成与设计

1.4.小干扰RNA(siRNA)的合成

1.5.主要仪器设备

1.6.生物学软件

1.7.常用试剂的配制

2.实验方法

2.1.对细胞的处理

2.2.细胞总RNA和总蛋白的提取

2.3.蛋白和RNA浓度测定

2.4.逆转录(Reverse Transcription，RT)与PCR扩增

2.5.Western Blot

2.6.感受态细胞的制备

2.7.细菌的转化

2.8.质粒提取及鉴定

2.9.蛋白的原核表达纯化及检测

2.10.GST-Pull Down试验

2.11.免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)试验

2.12.免疫荧光(Immunofluoresence，IF)

2.13.BrdU掺入实验(BrdU incorporation)与流式细胞分析(Flow Cytometry)

2.14.平板集落形成率检测

2.15.统计分析

实验结果

1.IQGAP1与Aurora-A的相互作用

2.HeLa细胞内IQGAP1与Aurora-A存在部分共定位

3.Aurora-A对IQGAP1的蛋白水平没有影响

4.IQGAP1对Aurora-A的mRNA水平没有影响

5.IQGAP1影响细胞内Aurora-A蛋白的表达

6.过表达IQGAP1使细胞内Aurora-A蛋白降解延迟

7.过表达IQGAP1引起细胞内Aurora-A多聚泛素链减少

8.IQGAP1影响Aurora-A与后期促进复合体(APC／C)的相互作用

9.鉴定IQGAP1与Aurora-A相互作用的结构域

10.Aurora-A siRNA能够影响IQGAP1引起的细胞增殖

11.IQGAP1增强Aurora-A的激酶活性

讨论

1.IQGAP1在几种恶性肿瘤中的表达

2.IQGAP1的相互作用蛋白以及参与的细胞信号通路

3.IQGAP1与Aurora-A相互作用且过表达IQGAP1引起Aurora-A蛋白水平的上调

4.IQGAP1对Aurora-A蛋白稳定性的影响

5.Aurora-A siRNA降低IQGAP1过表达引起的细胞增殖

6.展望

小结

参考文献

论文说明

博士在读期间发表及待发表的论文

综述

致谢

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