黄皮酰胺光学异构体的手性拆分及体外代谢研究

摘要

黄皮酰胺是从中药黄皮(Clausena lansium(Lourd.) Skeels)叶中分离得到的有效成分，是一个较有前途的手性促智药物，现已进入Ⅱ期临床研究。其左旋体有较好的促智作用，而右旋体效果不明显且有较强的毒性，而黄皮酰胺的其余14种光学异构体对人胚胎脑神经干细胞克隆的形成，对大鼠海马长时程增强以及对神经细胞胞质游离钙的影响作用均存在一定差异。本文对包括黄皮酰胺在内的16种光学异构体进行了体外代谢转化的研究，确定了各光学异构体的主要代谢产物并建立了黄皮酰胺代谢产物的分离和分析方法。利用所建立的分析方法，在体外代谢的基础上进行了体内代谢转化研究，确定了其体内代谢转化的主要途径，并发现了16种光学异构体在体外代谢转化上的立体选择性和代谢的差异。主要研究内容包括以下几个方面：
　　 1.16种黄皮酰胺光学异构体手性拆分
　　 建立RP-HPLC-DAD及NP-HPLC-DAD方法，分别使用α1-AGP酸性糖蛋白柱、AD、OJ及OD手性色谱柱对16种黄皮酰胺光学异构体进行拆分，16种黄皮酰胺光学异构体在不同的条件下分离度良好，并探讨了不同色谱柱可能的拆分机理。
　　 2．代谢体系的优化及分析方法的建立
　　 利用NADPH再生系统，优化了温孵体系，建立了LC/PDA/MS同时分离检测16种黄皮酰胺光学异构体及其代谢产物的分析方法，利用此方法从温孵体系中紫外检测器分离检测出150余个代谢产物，经质谱检测到约120种，并发现十六种黄皮酰胺光学异构体的主要代谢产物有明显的差异。
　　 3．代谢产物结构鉴定及主要代谢途径的确立
　　 按经优化的温孵体系对16种黄皮酰胺光学异构体进行体外温孵，利用LCMSIT-TOF对检测出的代谢物进行在线多级质谱分析。在该温孵体系中，黄皮酰胺多发生羟基化反应、脱甲基化反应、脱水反应、脱羟基化反应等。通过质谱信息，各母药的代谢物数量如下：（-）黄皮酰胺代谢物9种；(+)黄皮酰胺代谢物9种；(-)新黄皮酰胺代谢物7种；(+)新黄皮酰胺代谢物8种；(-)表黄皮酰胺代谢物5种；(+)表黄皮酰胺代谢物8种；(-)表新黄皮酰胺代谢物6种；(+)表新黄皮酰胺代谢物4种；(-)顺黄皮酰胺代谢物8种；(+)顺黄皮酰胺代谢物7种；(-)顺表黄皮酰胺代谢物8种；(+)顺表黄皮酰胺代谢物8种；（-）顺新黄皮酰胺代谢物6种；(+)顺新黄皮酰胺代谢物7种；(-)顺表新黄皮酰胺代谢物7种；(+)顺表新黄皮酰胺代谢物8种。最终确立了16种黄皮酰胺光学异构体的主要代谢途径。
　　 4.16种黄皮酰胺光学异构体代谢转化的立体选择性
　　 在相同温孵条件下，比较16种黄皮酰胺光学异构体在肝微粒体中的代谢情况，发现各黄皮酰胺光学异构体的主要代谢物存在显著差异，即P-450酶对黄皮酰胺光学异构体的代谢呈现出明显的底物立体选择性。根据主要代谢物的种类和含量，总结得出黄皮酰胺光学异构体的代谢规律。
　　 综上述研究表明，16种黄皮酰胺光学异构体由于其绝对构型的不同，在体外的代谢情况均有很大的差异。从代谢角度讲，这种差异是由于代谢酶催化的立体选择性决定的，这种生物活性的立体选择性为其药理活性差异的研究提供了理论依据。