禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的研究

摘要

环介导等温核酸扩增技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的4条引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶,在等温条件下(63℃～65℃)可高效、快速、高特异地扩增靶序列。本研究针对ALV的gag基因设计引物,筛选禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增方法特异性引物、优化禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增方法的条件,建立禽白血病病毒逆转录环介导等温扩增快速检测方法(ALVRT-LAMP),并研究RT-LAMP方法用于临床检测ALV的可行性,为ALV的快速诊断、病原监测及分子流行病学调查提供有力工具。
　　 本研究针对ALVgag基因保守区设计合成的4套ALVRT-LAMP特异性引物,对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽网状内皮细胞增生征病毒(REV)、鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽流感病毒(AIV)等病原核酸扩增结果均为阴性。以其中一套特异性引物为反应引物,ALVRAV-1毒株为试验模板对ALVRT-LAMP反应体系的Betaine、Mg2+、dNTP、BstDNA大片段聚合酶、AMV反转录酶、引物等反应试剂的用量及温度、时间等反应条件进行了优化,确定了最佳反应体系。ALVRT-LAMP扩增结果通过直接观察扩增产物的浊度、凝胶电泳观察斑马样条带的生成、荧光检测法及实时浑浊仪检测LAMP反应四种方式进行判定,尤以LAMP方法特征性结果判定方式直接观察扩增产物浊度最为简单便捷。初步建立了ALVRT-LAMP方法。
　　 ALVRT-LAMP敏感性试验结果显示,RT-LAMP方法能够检测0.2TCID50/0.1mL禽白血病病毒或1pg病毒核酸,且与ELISA方法、PCR方法比较,RT-LAMP方法敏感性更高。ALVRT-LAMP特异性试验的酶切鉴定和测序结果均与理论结果相符,表明RT-LAMP方法可以特异性扩增ALV。且60分钟内便可完成扩增反应。本研究成功建立了ALVRT-LAMP方法。
　　 将建立的ALVRT-LAMP方法对60批禽用活疫苗进行了禽白血病病毒污染检验,结果RT-LAMP方法检测出11批阳性样品(18.3％)。用标准规定的ELISA方法检测出10批阳性(16.67％)。RT-LAMP方法与ELISA方法的阳性符合率为91％。
　　 RT-LAMP方法是一种简单快速灵敏的检测ALV的方法。ALVRT-LAMP方法的建立为禽用活疫苗中污染ALV的检测提供了新的参考方法,也为兽医临床样品的ALV检测提供新的检测方法。