基于核酸适配体的乳腺癌靶向治疗系统的构建及多壁碳纳米管间接毒性的体外研究

摘要

第一部分，基于核酸适配体的乳腺癌靶向治疗研究
　　 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其中约20～30％为HER2阳性。HER2阳性的乳腺癌侵袭性强，预后差，且易对内分泌治疗和化疗产生抵抗。虽然曲妥珠单抗可以靶向性地治疗HER2阳性的乳腺癌，但该治疗对相当一部分患者无效，且有效患者中的绝大多数很快会发生获得性耐药。因此，研发新型的针对HER2的靶向治疗策略，具有较为重大的医学意义。核酸适配体(aptamer)在构建新型肿瘤靶向治疗体系方面，有较大的应用潜能。但迄今为止，应用HER2适配体来构建乳腺癌靶向治疗体系的研究，尚未见文献报道。本课题利用SELEX技术，以HER2表位肽为靶标，筛选到了一种全新的针对HER2的DNA适配体，以此适配体为基础构建了靶向HER2的载细胞毒药物体系，并在体外对该靶向载药模型进行了初步评估。主要研究工作如下：
　　 1．利用SELEX技术，以HER2表位肽为靶标，以流式细胞术检测每轮筛选中适配体库的富集程度和HER2适配体的相对亲和力，我们筛选到了一种全新的HER2适配体(HB5)。该适配体含86个碱基，与HER2多肽的亲和系数为18.9nm。
　　 2．为评估适配体HB5与HER2结构的结合特异性，我们以随机DNA库作对照，利用流式细胞术评估了FITC标记的HB5与HER2蛋白、胰酶和BSA的结合情况。结果显示，HB5能够选择性的结合HER2蛋白的胞外结构域，但基本不结合BSA和胰酶。
　　 3．为评估适配体HB5与HER2阳性或HER2阴性细胞的结合性质，我们将FITC标记的HB5分别与多种HER2阳性或HER2阴性细胞孵育，并行流式细胞术检测。结果显示，HB5能够选择性的结合HER2阳性的乳腺癌肿瘤细胞系，而基本不结合HER2阴性的细胞系。
　　 4．通过将阿霉素(Dox)嵌入适配体的DNA结构中，我们构建了HER2适配体-陋J霉素(Apt-Dox)靶向载药系统，并利用阿霉素嵌入DNA结构中后其自发荧光淬灭的原理，对优化该系统的参数进行了评价。结果显示，当适配体与阿霉素的摩尔比为0.1时，阿霉素的自发荧光基本淬灭，提示大部分阿霉素已经嵌入HB5的DNA结构并与适配体形成了复合体。
　　 5．为在体外评估Apt-Dox靶向体系的有效性，我们用Apt-Dox，Apt和Dox，分别与HER2阳性或HER2阴性的肿瘤细胞共孵育，利用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和MTS法进行检测。结果显示，Apt-Dox能够被HER2阳性细胞选择性地摄入，并且降低了Dox对HER2阴性细胞的杀伤作用(p＜0.05)。
　　 本研究首次以HER2表位肽为靶点，筛选出了能够结合HER2蛋白及HER2阳性乳腺癌细胞的DNA适配体HB5。相关实验结果显示，HER2适配体可以靶向性地将阿霉素带入HER2阳性的乳腺癌细胞。鉴于多种恶性肿瘤（乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食管癌和膀胱癌等）都可能过量表达HER2，HER2适配体有可能在针对这些肿瘤的新型靶向诊疗技术方面，具备一定的应用潜能。
　　 第二部分，多壁碳纳米管间接毒性的体外研究
　　 碳纳米管作为一种重要而有代表性的纳米材料，在生物医学领域有着广泛的应用价值，其生物安全性越来越受到关注。免疫系统在疾病发生过程中会导致组织损伤，因此非常有必要探索碳纳米管是否能够通过影响免疫功能而产生毒性。本研究主要在体外评估了人淋巴细胞介导的碳纳米管毒性，发现低浓度的碳纳米管(0．001-0.1ug／ml)不会直接引起明显的细胞死亡或凋亡，但是能够增强淋巴细胞介导的细胞毒作用杀伤多种肿瘤细胞系。此外，碳纳米管能够刺激淋巴细胞分泌IFN—γ和TNF-α，并且激活淋巴细胞的NF-кB通路，使细胞核内的p65蛋白表达增加；而抑制NF-кB通路能够降低CNT引起的淋巴细胞介导的细胞毒作用。本研究提示低浓度的CNT有可能通过影响淋巴细胞功能而对各种靶细胞产生间接的杀伤作用。

目录

第一部分 基于核酸适配体的乳腺癌靶向治疗研究

摘要

第一章 绪论

1.乳腺癌

2.HER2过表达型乳腺癌

3.适配体

4.选题依据及研究意义

5.研究策略和技术路线

参考文献

第二章 实验材料和方法

1.实验材料和试剂

2.实验仪器和设备

3.实验方法

第三章 实验结果与分析

1.体外筛选

2.适配体性质分析

3.适配体-阿霉素载药体系(Apt-Dox)

第四章 讨论与结论

1.讨论

2.结论

参考文献

第二部分 多壁碳纳米管间接毒性的体外研究

摘要

第一章 绪论

1.碳纳米管概述

2.碳纳米管在生物医学领域的应用

3.碳纳米管的毒性

4.本论文的研究思路

第二章 实验材料与方法

1.实验材料和试剂

2.实验仪器和设备

3.多壁碳纳米管(MWCNTs)水溶液的制备

4.人肿瘤细胞和正常细胞的培养

5.人外周血单个核细胞制备

6.碳纳米管对淋巴细胞介导的细胞毒性研究

7.统计分析

第三章 实验结果与分析

1.功能化MWCNTs

2.MWCNTs促进淋巴细胞介导的细胞毒性

3.MWCNTs不影响肿瘤细胞和正常细胞的活性

4.MWCNTs不影响淋巴细胞的增殖或凋亡

5.MWCNTs促进淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α

6.MWCNTs可能通过NF-κB通路影响淋巴细胞对靶细胞的杀伤

第四章 讨论与结论

1.讨论

2.结论

参考文献

附录一 英文缩略词汇表

附录二 文章题录

附录三 非论文综述

致谢

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