肺癌细胞系KRAS突变检测及联合通路抑制剂的生长抑制作用

摘要

自2010年以来，肺癌的靶向治疗取得了很大进展，出现了许多针对EGFR，MET，HER2，VEGF和ALK等靶点的小分子药物，尤其是针对EGFR的靶向药物在临床上显示了很好的疗效。但是仍有一部分患者耐药，难以从EGFR的靶向治疗中获益[1]。这部分患者，细查原因，大部分是因为肿瘤细胞中存在KRAS突变[2]，但往往还有其他基因如PIK3CA和PTEN等基因的突变[3-5]。这些耐药的患者的治疗也成为了临床上的难点，本课题即致力于这一方面的研究。
　　 自80年代在人类肿瘤中检出突变KRAS以来，因其与人类肿瘤的密切关系而备受关注，关于它的文献数以万计。大部分以临床肿瘤标本为研究对象，也有以多种KRAS突变肿瘤细胞系为基础进行研究的。为探讨KRAS突变患者能否从小分子靶向治疗药物中获益，我们选用KRAS突变肺癌的肿瘤细胞模型进行实验。为了明确细胞资源中心所保藏的肿瘤细胞系中KRAS及相关的BRAF，EGFR，PIK3CA基因的突变情况，我们使用高分辨率溶解曲线技术(HRM)对库藏人类肿瘤细胞系进行突变的检测。
　　 首先，我们提取了173种肿瘤细胞的总DNA，根据以往文献报导KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因突变的热点所在的6个DNA片段，进行PCR扩增，获得高拷贝数的目标序列。然后进行高分辨率熔解。在时间和荧光的曲线上区分出野生型，突变杂合型和突变纯合型的细胞系。筛查结果显示在肿瘤细胞系中KRAS突变在所筛查的4个基因中最为常见，其中胰腺癌细胞系突变率为66.67％，结直肠癌细胞系为52.94％，肺癌细胞系为21.25％，是突变率最高的三种肿瘤细胞系，与文献报道的临床肿瘤患者中KRAS的突变频率相当:胰腺癌＞80％，结直肠癌≈50％，肺癌10-30％[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突变在肿瘤细胞系中突变频率分别为14.45％、6.35％和4.62％。另外，我们还检测到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1细胞系中的一些未见报导的基因突变情况。
　　 筛查结果明确了KRAS及相关基因在人类肿瘤细胞系中的突变情况，为开展肿瘤的靶向治疗研究提供了很好的模型。同时证明HRM技术是一种低成本，灵敏，特异和高通量的实验手段。
　　 根据前述突变检测结果，选择我们KRAS单突变的A549和KRAS/PTEN双突变的NCI-H157两株NSCLC细胞，观察两种信号通路抑制剂GDC-0941（PI3K/AKT/mTOR通路，PI3K抑制剂）和AZD6244（KRAS/RAF/MEK通路，MEK抑制剂）对不同突变的NSCLC细胞的用药效果。分别用不同浓度的GDC-0941和AZD6244单独或联合作用，MTT法初步观察对细胞增殖的影响。根据观察结果确定联合给药的浓度。设立无药对照组、PI3K单独抑制组(GDC-0941，0.5/5.0μmol/L)、联合Ⅰ组(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ mol/L GDC-0941)及联合Ⅱ组(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。细胞经过不同组合浓度的抑制剂作用后，MTT法绘制增殖抑制曲线;平板集落形成法检测集落形成能力的改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布;Western blot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。
　　 在两株NSCLC细胞中，单独抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果较差。抑制剂AZD6244或GDC-0941作用于A549细胞的抑制率分别可达25.5％和38.1％，作用于NCI-H157细胞的抑制率分别可达16.9％和35.1％。Westernblot结果显示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后（降低pERK活化）激活PI3K/AKT/mTOR通路（增强pAKT活化）。相反，GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。结果表明单通路突变的细胞，仅抑制该突变通路，效果差。未突变通路的抑制剂对肺癌细胞的增殖也有抑制作用。无论肺癌细胞是KRAS单突变，还是KRAS/PTEN双突变，单通路抑制效果较差，需要双通路联合抑制提高疗效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可增强KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。在NCI-H157细胞中，低剂量的联合Ⅰ组表现为两药协同作用（q值=1.22），高剂量的联合Ⅱ组表现为两药相加作用（q值=0.92）;集落形成能力下降[77.2±1.54个/孔VS61.5±2.12个/孔，P＜0.01]和[51±4个/孔VS22.5±3.53个/孔，P＜0.01];凋亡率增加[18.3±0.82％ VS21.32±0.56％，P＜0.01]和[27.14±1.58％ VS42.45±4.42％，P＜0.01];细胞周期分布发生改变，联合抑制组G0/G1期细胞增加，S期明显减少(P＜0.01)。Western blot显示，联合抑制组与PI3K单独抑制组相比，CyclinD1，CyclinB1表达量减少，P21表达量和PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比值下降。表明双通路联合抑制，可降低剂量，增强药效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制亦可增强KRAS单突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。但是由于两条通路的相互制衡作用，药效受两通路相对抑制情况的影响。在A549细胞中，联合Ⅰ组与低剂量的PI3K单独抑制组相比，两抑制剂表现为拮抗作用(q=0.58)，对肺癌细胞的增殖抑制作用未见增强，反而刺激了细胞的生长，集落形成能力[114.5±3.53个/孔VS133±4.24个/孔，P＜0.01]，细胞周期的分布及凋亡率无明显差异。联合Ⅱ组与高剂量PI3K抑制组相比，两抑制剂表现为相加作用(q=0.90)，细胞的增殖抑制作用出现了明显增强，集落形成能力明显下降[75.5±3.53个/孔VS50.5±4.94个/孔，P＜0.01];凋亡率显著增加[37.85±3.18％ VS52.27±4.36％，P＜0.01]，细胞周期分布发生改变，联合抑制组G0/G1期细胞增加，S期明显减少(P＜0.01)。Western blot显示，CyclinD1，CyclinB1表达量减少，PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比值下降。
　　 总之，RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可使KRAS单突变和KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的治疗获益，尤其是在KRAS/PTEN双突变NSCLC细胞中表现为协同作用。但是对于KRAS单突变NSCLC细胞，联合抑制效果受到药物剂量和相关信号通路中基因状态的影响。所有结果表明，在肺癌的个体化治疗时需检测信号通路上的多个基因的突变状态，联合信号通路小分子抑制剂的靶向治疗将使更多患者受益。

目录

缩略语表

摘要

引言

第一部分：KRAS及相关基因在人类肿瘤细胞系中的突变情况的筛查

引言

实验材料

实验方法

实验结果

一、HRM前期样本的准备及引物条件的摸索

二、HRM数据分析

三、库藏肿瘤细胞系KRAS和相关基因检测结果及测序验证

四、未见报导的6例突变细胞系及测序图

讨论

第二部分：联合通路抑制剂对非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用

引言

实验材料

实验方法

实验结果

一、联合通路抑制剂对两种细胞生长的抑制作用

二、联合通路抑制剂对细胞信号通路的抑制作用

三、平板集落形成实验检测增殖能力的结果

四、联合通路抑制剂对细胞周期分布的影响

五、联合通路抑制剂对细胞凋亡的影响

六、联合通路抑制剂对靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的影响

讨论

小结

参考文献

附录 文献综述

致谢

个人简历

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