基于LC-MS/MS技术的2型糖尿病血清脂质组学研究

摘要

本论文采用快速高分辨液相色谱（RRLC）分离系统与MS/MS的联用技术，通过灵敏度、精密度、稳定性等方法学的细致考察，建立了适用于2型糖尿病血清样本的脂质组学高通量分析方法。首先，优化并建立了脂质组学血清样本前处理及其RRLC-MS分析方法，并将该方法应用于2型糖尿病患者与健康志愿者血清样本的脂质组学研究，分别筛选出42个与2型糖尿病诊断密切相关、52个与2型糖尿病治疗密切相关的脂质类潜在生物标志物。采用高分辨MS及MS/MS谱分析及其质谱裂解规律的解析，结合代谢相关性网络分析和数据库检索等手段，分析推断可能生物标志物的结构，截止目前共鉴定出84个脂质类潜在生物标志物的可能结构。此外，针对脂质类生物标志物的代谢途径进行分析，推断2型糖尿病的诊断、治疗可能与甘油磷脂、甘油三酯、胆固醇酯及鞘磷脂代谢紊乱存在密切关系。
　　本论文的主要研究内容如下:
　　1.脂质组学血清样本前处理及其RRLC-MS分析方法的研究
　　本论文通过对血清样本前处理条件、色谱条件和质谱条件的优化，尤其对血清样本中脂质类成分的提取方法、复溶溶剂及复溶体积、样本稳定性等进行了细致的考察，并对该方法的精密度、灵敏度和稳定性进行了验证，建立了适用于脂质组学研究的血清样本前处理及其RRLC-MS分析方法。研究发现从血清样本中提取脂质类成分的完整性对脂质组学分析方法有非常重要的意义。因此，针对不同脂质提取溶剂的脂质提取量与操作平行性进行了系统考察，最终确定采用二氯甲烷-甲醇(2∶1，V/V)混合溶剂作为脂质提取溶剂。此外，对建立的RRLC-MS分析方法进行了精密度、灵敏度和稳定性的方法学考察，结果表明本方法的精密度符合血清样本分析的要求、稳定性良好，大部分脂质类代谢物的检测灵敏度较高，适用于血清样本的脂质组学分析。
　　2.RRLC-MS分析方法在2型糖尿病脂质组学研究中的应用
　　采用建立的RRLC-MS分析方法，开展了80例2型糖尿病患者与28例健康志愿者血清样本的脂质组学研究，以寻找与2型糖尿病诊断、治疗密切相关的潜在脂质类生物标志物。本研究分别发现42个与2型糖尿病诊断密切相关、52个与2型糖尿病治疗密切相关的脂质类潜在生物标志物。进一步采用高分辨MS及MS/MS谱分析及其质谱裂解规律的解析，结合代谢相关性网络和数据库检索，分析推断了这些脂质类潜在生物标志物的可能结构。结果鉴定出35个与2型糖尿病诊断密切相关的脂质类潜在生物标志物的结构，其中包括2个脂肪酸、6个甘油三酯，3个胆固醇酯，1个鞘磷脂，23个甘油磷脂等;另外鉴定出49个与2型糖尿病治疗密切相关的脂质类潜在生物标志物的结构，其中包括2个脂肪酸、1个甘油三酯，2个胆固醇酯，11个鞘磷脂，33个甘油磷脂等。分析认为这些脂质类代谢物的异常可能与2型糖尿病患者体内的代谢紊乱存在密切关系，其中在2型糖尿病的初期诊断时，甘油磷脂及甘油三酯含量显著升高，胆固醇酯含量显著降低;随着病程发展，甘油磷脂和鞘磷脂含量显著升高。因此，分析推断2型糖尿病的诊断、治疗可能与甘油磷脂、甘油三酯、胆固醇酯及鞘磷脂代谢紊乱密切相关。

目录

缩略语一览表

摘要

第一章 绪论

1 脂质组学概述

1．1 脂质类化合物的简介

1．2 脂质组学的研究内容

1．3 脂质组学的研究方法

1．4 脂质组学的研究进展

2 糖尿病概述

2．1 糖尿病的分类

2．2 糖尿病的诊断标准

2．3 糖尿病的预防

3 基于脂质组学的2型糖尿病研究进展

3．1 疾病诊断脂质类指标的确定

3．2 糖尿病脂质类生物标志物的识别

3．3 药物靶点及先导化合物的发现

3．4 药物作用机制的研究

4 研究目的及主要研究内容

4．1 研究目的

4．2 研究内容

参考文献

第二章 基于LC-MS技术的血清脂质组学分析方法研究

1 前言

2 实验部分

2．1 样品及试剂

2．2 血清样品的制备

2．3 标准品溶液的制备

2．4 实验仪器与条件

2．5 方法学验证

3 结果与讨论

3．1 血清样本前处理方法的优化

3．2 RRLC-MS分析方法的优化

3．3 方法学验证

4 小结

参考文献

第三章 基于LC-MS／MS方法的2型糖尿病血清脂质组学研究

1 前言

2 实验部分

2．1 样品及试剂

2．2 血清样品的制备

2．3 对照品溶液的制各

2．4 实验仪器与条件

3 结果与讨论

3．1 数据质量控制

3．2 数据处理及其结果

3．3 差异代谢物的结构鉴定

3．4 健康志愿者Control组与2型糖尿病患者NDD组的差异代谢物结构鉴定结果

3．5 2型糖尿病患者LTY组与2型糖尿病患者MTY组的差异代谢物结构鉴定结果

3．6 脂质类生物标志物的诊断敏感性与特异性

3．7 生物学意义的阐述

4 小结

参考文献

第四章 总结

附录

发表论文及参加学术会议情况

致谢

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