志贺氏菌VirB蛋白激活毒力基因转录的分子机理研究

摘要

在现代社会中，细菌性痢疾仍然是全球公共卫生安全面临重大威胁之一。在发展中国家，细菌性痢疾的危害尤为严重。志贺氏菌属于革兰氏阴性杆菌，是导致细菌性痢疾的首要病原体。志贺氏菌可分为四个血清群，包括了A群:志贺氏痢疾杆菌(S.dysenteriae)，B群:福氏痢疾杆菌（S.flexneri），C群:鲍氏痢疾杆菌(S.boydii)和D群:宋内氏痢疾杆菌(S.sonnei)。在我国，福氏痢疾杆菌为主要的流行菌株。在以往的研究工作中，我们于2001年完成了福氏痢疾杆菌2a301株的全基因组序列测定，是我国首个独立完成的微生物基因组项目，为志贺氏菌的致病机理研究提供了完整的遗传背景信息。
　　 志贺氏菌的基因组序列与大肠杆菌高度同源，其致病性主要基于细菌中约230Kb的侵袭性大质粒。痢疾杆菌的毒力基因集中分布在侵袭性大质粒中约31Kb的”entry region”中。这些毒力基因编码了包括细菌毒素，三型分泌系统(T3SS)的结构蛋白及效应因子等大量蛋白质。因此，毒力基因的表达无疑为细菌造成巨大的代谢负担。因此，在进化的过程中，志贺氏菌形成了一个精巧的毒力基因转录和表达调控体系，由来自侵袭性大质粒的调控系统和来自细菌基因组编码的全局调控系统共同组成。
　　 在不适宜的环境条件下，志贺氏菌的毒力基因的表达受到抑制。染色体编码的H-NS蛋白通过结合毒力基因启动子附近的AT富集区组装转录抑制复合物，阻止RNA聚合酶向启动子下游移动，从而在转录水平抑制毒力基因表达。在适宜环境因素的诱导下，即温度，pH值和渗透压等环境参数与小肠内环境接近时，志贺氏菌的毒力基因的转录开始激活。毒力基因的激活通过一系列级联调控步骤实现。首先包括了virF基因的转录激活，其产物VirF蛋白继而激活virB基因的转录，造成VirB蛋白的表达上调。VirB蛋白能够特异性结合位于毒力基因启动子上游的DNA顺式作用位点(cis-acting site)，从而解除H-NS介导的转录抑制作用，最终导致位于侵袭性大质粒上的各种毒力基因的转录的全面激活。受到VirB蛋白调控的毒力基因还包括了VirB自身的编码基因及其上游调控基因virF。
　　 VirB蛋白在志贺氏菌的毒力基因转录调控中具有核心作用，然而VirB如何解除H-NS的转录抑制作用的分子机理尚不清楚。氨基酸序列比对分析表明VirB蛋白与传统转录调控因子的同源性很低，却与质粒分离蛋白ParB，SopB，KorB同源性较高。VirB特异性结合位于启动子上游的顺式作用位点，该位点与ParB类蛋白识别的ParS序列具有高度的同源性，均包括了两个保守的反向重复序列Box-1和Box-2。由此可见，VirB蛋白与质粒分离蛋白密切相关。然而，现有的实验证据表明VirB蛋白未参与质粒分配过程。由此，我们推测，VirB蛋白可能在进化的过程中逐渐失去了原有的质粒分配功能，扮演了基因转录调控的角色，然而其祖先分子的结构特征及与DNA相互作用的特性被保留下来。
　　 为揭示VirB蛋白特异性识别DNA顺式作用位点的分子基础和VirB蛋白激活毒力基因转录的分子机制，我们结合了结构生物学，生物物理及生物化学和细菌学等多学科技术方法，针对VirB-DNA相互作用开展了系统的研究。
　　 我们首先解析了VirB蛋白核心结构域(VirB core)与icsB毒力基因上游DNA顺式作用位点icsB-WT(26bp)复合物，VirB蛋白核心结构域与icsP毒力基因上游DNA顺式作用位点icsP-WT(31bp)复合物晶体结构，揭示了VirB蛋白与ParB类蛋白在多肽骨架结构上同源，具有典型的HTH motif。我们的晶体结构展示:VirB核心结构域直接结合顺式作用位点DNA双螺旋结构的“大沟”(majorgroove)，是VirB蛋白识别序列特异性的决定因素。VirB核心结构域与DNA磷酸骨架及DNA碱基之间形成11个稳定的分子间盐桥和氢键，从而实现对DNA序列的“阅读”，其中最重要的DNA序列识别由精氨酸R167完成。我们发现:R167的侧链与DNA顺式作用位点icsB-WT和icsP-WT中的Box-2第三位的鸟氨酸碱基形成两个重要的氢键，是唯一识别DNA碱基的氨基酸。与ParB类似蛋白结合DNA复合物的晶体结构比对发现，ParB类似蛋白结合反向重复序列中的两个Box，而VirB蛋白仅结合反向重复序列中的一个，即Box-2，从而揭示了VirB蛋白与ParB类蛋白在DNA结合方面最核心的区别。我们随后开展突变实验，验证了参与DNA识别的11个氨基酸中有10个氨基酸是VirB转录激活活性所必须的，从而建立了VirB识别DNA序列特异性的结构基础并验证了序列识别与其功能的关联。我们进而对结合于VirB蛋白的DNA icsB-WT和icsP-WT的结构进行分析，发现DNA双螺旋结构发生扭曲，主要体现在DNA螺旋轴发生明显的弯曲及DNA“小沟”（minor groove）变窄等。DNA双螺旋构象的变化证明了VirB蛋白对DNA结构改变的能力。而这种能力是ParB类似蛋白所不具有的。我们接下来利用荧光光光谱分析的方法研究了VirB全长蛋白（包括了N-端结构域，核心结构域和C端结构域）与DNA顺式作用位点的相互作用。我们发现VirB的N-端和C-端结构域均具有DNA结合能力，然而这种DNA结合能力是不依赖DNA的碱基序列的。VirB与DNA的结合具有显著的协同性，其原因为VirB的C-端结构域可介导VirB蛋白的寡聚化，从而为DNA的结合提供多个位点。
　　 综合以上研究成果，我们最终提出VirB解除H-NS抑制毒力基因转录的分子模型，即VirB蛋白通过C-端结构域发生寡聚化，形成VirB的多聚体。VirB通过核心结构域准确定位到启动子上游的顺式结合位点，并结合反向重复序列中的Box-2。VirB的结合引发DNA双螺旋的构象变化，主要体现在:造成DNA双链在顺式作用位点处发生弯曲;DNA的弯曲使进而引起下游DNA结合到VirB多聚体的其他DNA结合位点;最终造成DNA在VirB多聚体上的缠绕。VirB诱导的DNA构象变化可破坏H-NS-DNA转录抑制复合物的稳定性，释放RNA聚合酶复合物，激活毒力基因的转录。
　　 志贺氏菌不但是重要的病原微生物，而且是细菌致病性研究中重要的模式生物之一。细菌毒力和侵袭力的调控机制显然细菌致病性研究的核心科学问题之一，也是药物设计的重要靶标。本研究阐明了VirB识别DNA顺式作用序列的结构基础，提出了VirB解除H-NS介导的转录抑制作用的分子模型，为阐明痢疾杆菌毒力基因调控机理提供了重要基础，为相关的抑制剂及药物设计提供了科学理论依据。

目录

声明

摘要

引言

志贺氏菌致病机理

志贺氏菌致病的分子机制

总结

志贺氏菌毒力调控因子VirB蛋白研究进展

本课题研究内容和意义

1．VirB蛋白结构生物学研究

2．VirB蛋白的生物物理及生物化学的研究

3．VirB蛋白的体内细菌学研究

1．材料

1．1 菌株

1．2 DNA

1．3 质粒

1．4 常用试剂和耗材

1．5 常用溶液

1．6 常用仪器和设备

2．方法

2．1 质粒构建

2．2 virB基因突变菌株的构建

2．3 蛋白表达纯化

2．4 硒代蛋白表达纯化

2．5 荧光光谱实验

2．6 复合物的组装

2．7 晶体的初筛

2．8 晶体优化

2．9 晶体数据收集与结构解析

2．10 凝胶阻滞实验

2．11 beta半乳糖苷酶活性测定

3．结果

3．1 VirB蛋白与质粒分离蛋白同源

3．2 蛋白表达和纯化

3．3 VirB蛋白结合DNA的模式

3．4 VirB蛋白晶体学研究

3．5 VirB蛋白核心结构域与DNA复合物的结构

3．6 VirB蛋白体外结合DNA特性

3．7 VirB蛋白结构与功能的关系

3．8 VirB蛋白R167氨基酸功能

4．讨论

4．1 VirB蛋白核心结构域与质粒分离蛋白ParB高度同源

4．2 VirB蛋白结构核心结构域C端螺旋束的功能

4．3 VirB蛋白核心结构域结合box2生物学意义

4．4 VirB蛋白C端结构域参与蛋白与DNA高分子复合物的组装

4．5 VirB蛋白特异性和非特异性结合DNA

4．6 R167为VirB蛋白特异性识别DNA的重要氨基酸

5．结论

参考文献

附录

致谢

个人简历及发表文章