青蒿素衍生物对宫颈癌细胞生物学行为影响及对人脐静脉内皮细胞血管形成能力影响的研究

摘要

目的:
　　 1.观察青蒿素衍生物双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌Hela和Caski细胞体外增殖及凋亡能力的影响，并探讨其分子机制。
　　 2.观察青蒿素衍生物双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌Hela和Caski细胞体外侵袭能力的影响，并探讨其分子机制。
　　 3.观察青蒿素衍生物双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌Hela和Caski细胞血管形成相关分子表达的影响和对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外增殖及血管形成能力的影响。
　　 4.观察青蒿素衍生物双氢青蒿素和青蒿琥酯对顺铂耐药株宫颈癌细胞（Siha细胞）体外增殖能力的影响。
　　 方法:
　　 1.将宫颈癌Hela和Caski细胞分别接种培养于含10％胎牛血清的DMEM高糖和RPMI-1640培养基。加入设定浓度（0μmol/L～62.5μ mol/L）的双氢青蒿素、青蒿琥酯和对照药物（顺铂），设定培养时间(6，12，24，48，72h)，用MTT法观察青蒿素衍生物对宫颈癌细胞增殖的影响，并用Annexin-(V)和PI双标记进行流式细胞仪检测，以观察青蒿素衍生物对宫颈癌细胞体外凋亡能力的影响，同时用Western blot法检测双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌细胞有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)磷酸化水平的影响。
　　 2.对经过上述药物处理的宫颈癌细胞上清液，用标准ELISA法检测青蒿素衍生物对宫颈癌细胞血管形成和侵袭相关分子血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)，血小板反应素-1(TSP-1)，基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(TIMPs)蛋白分泌的影响，同时用聚合酶链反应(PCR)检测青蒿素衍生物对上述分子mRNA表达水平的影响。用Western blot法检测双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌细胞聚焦黏附激酶(FAK，Focal Adhesion Kinase)磷酸化水平的影响。然后用Matrigel包被的Transwell跨膜小室模型观察青蒿素衍生物对宫颈癌细胞侵袭能力的影响。
　　 3.对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养和传代。加入设定浓度(0μmol/L～125μmol/L)的双氢青蒿素和青蒿琥酯，设定培养时间(6，12，24，48，72h)，用MTT法观察青蒿素衍生物HUVEC体外增殖的影响。应用Matrigel体外管样结构形成模型来观察，双氢青蒿素对HUVEC体外管样结构形成能力的影响。
　　 4.对顺铂诱导的多药耐药Siha细胞进行培养和传代。加入设定浓度（0μmol/L～125μmol/L）的青蒿素衍生物（双氢青蒿素和青蒿琥酯），设定培养时间(6，12，24，48，72h)，用MTT法观察青蒿素衍生物对Siha细胞增殖的影响。
　　 结果:
　　 1.MTT分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯对宫颈癌Hela和Caski细胞增殖能力有明显的抑制作用，并存在药物浓度和时间依赖性;双氢青蒿素和青蒿琥酯对Hela细胞48小时的IC50分别为8.9±1.1μmol/L和10.5±1.2μmol/L;双氢青蒿素和青蒿琥酯对Caski细胞72小时的IC50分别为10.3±1.0μmol/L和13.3±1.4μmol/L。
　　 2.Western blot分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯能降低宫颈癌细胞有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)，家族中ERK1/2的磷酸化水平，与不加药物的对照组相比，双氢青蒿素使Hela和Caski细胞中ERK1/2磷酸化水平分别降低70.5±2.6％(p＜0.05)和68.8±2.2％(p＜0.05)，青蒿琥酯使Hela和Caski细胞中ERK1/2磷酸化水平分别降低65.8±2.9％(p＜0.05)和56.7±2.4％(p＜0.05)。
　　 3.Annexin-5和PI双标记凋亡检测分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯对子宫颈癌Hela和Caski细胞有促凋亡作用。与不加药物的对照组相比，加入双氢青蒿素后12小时Hela和Caski细胞的凋亡指数分别增加51.0±3.6％(p＜0.05)和24.6±2.5％(p＜0.05);加入青蒿琥酯12小时后，Hela和Caski细胞的凋亡指数分别增加38.4±3.2％(p＜0.05)和19.3±2.7％(p＜0.05)。
　　 4.Western blot分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯能升高子宫颈癌细胞MAPKs家族中p38的磷酸化水平。与不加药物的对照组相比，双氢青蒿素使Hela和Caski细胞P38磷酸化水平分别升高57.3±2.4％(p＜0.05)和54.8±3.1％(p＜0.05)，青蒿琥酯使Hela和Caski细胞P38磷酸化水平分别升高47.0±3.0％(p＜0.05)和43.8±2.8％(p＜0.05)。
　　 5.跨膜小室模型显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯对子宫颈癌Hela和Caski细胞的体外侵袭能力具有明显的抑制作用。双氢青蒿素使Hela和Caski细胞的侵袭能力降低76.2±2.6％(p＜0.05)和67.2±2.9％(p＜0.05)，青蒿琥酯可使Hela和Caski细胞的侵袭能力降低68.1±2.7％(p＜0.05)和59.3±2.8％(p＜0.05)。
　　 6.Western blot分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯能降低宫颈癌细胞的聚焦黏附激酶(Focal Adhesion Kinase，FAK)的磷酸化水平。与不加药物的对照组相比，62.5μmol/L的双氢青蒿素分别使Hela和Caski细胞FAK磷酸化水平下调66.8±2.2％(p＜0.05)和54.6±2.7％(p＜0.05)，青蒿琥酯分别使Hela和Caski细胞系FAK磷酸化水平下调48.9±2.6％(p＜0.05)和42.1±2.3％(p＜0.05)。
　　 7.MTT分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯可抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外增殖能力。双氢青蒿素和青蒿琥酯对HUVEC72小时的IC50分别为11.4±1.4μmol/L和17.1±1.1μmol/L。
　　 8.Matrigel基质管样结构形成模型显示，双氢青蒿素可以抑制HUVEC体外管样结构形成的能力，且此作用具有浓度依赖性。与未加入药物的对照组相比，62.5μmol/L的双氢青蒿素能使HUVEC在Matrigel基质中的管样结构形成减少62.3％，其效果相当于10-9mol/L的紫杉醇。
　　 9.MTT分析显示，双氢青蒿素和青蒿琥酯可抑制顺铂耐药细胞（Siha细胞）的体外增殖能力，此抑制作用存在药物浓度和时间的依赖性。双氢青蒿素和青蒿琥酯对Siha细胞72小时的IC50分别为36.1±1.7μmol/L和43.0±1.5μmol/L。
　　 结论:
　　 1.双氢青蒿素和青蒿琥酯具有抑制宫颈癌Hela和Caski细胞的体外增殖能力，该作用可能与下调癌细胞内ERK1/2蛋白的磷酸化水平相关。
　　 2.双氢青蒿素和青蒿琥酯能促进宫颈癌Hela和Caski细胞的早期凋亡，该作用可能与其上调癌细胞内P38蛋白的磷酸化水平相关。
　　 3.双氢青蒿素和青蒿琥酯可抑制宫颈癌Hela和Caski细胞的体外侵袭能力，该作用可能与其下调FAK蛋白的磷酸化水平相关。
　　 4.双氢青蒿素和青蒿琥酯均能抑制人脐静脉内皮细胞体外增殖，体外血管形成模型证实双氢青蒿素可抑制其管样结构形成的能力。
　　 5.双氢青蒿素和青蒿琥酯对顺铂耐药宫颈癌细胞株（Siha细胞）体外增殖具有一定抑制作用。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 青蒿素衍生物对子宫颈癌细胞株体外增殖和凋亡作用的影响及其机制

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分 青蒿素衍生物对宫颈癌细胞体外侵袭能力及血管形成能力影响的研究

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第三部分 青蒿素衍生物对子宫颈癌细胞血管形成分子表达的影响及对血管内皮细胞体外增殖和管样结构形成能力的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第四部分 青蒿素衍生物对子宫颈癌顺铂耐药细胞的体外增殖作用的影响

材料与方法

实验结果

讨论

小结

全文小结

参考文献

综述

致谢

个人简历

在读期间发表论文情况

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