iASPP过表达对造血干祖细胞自我更新的影响以及抗凋亡作用的研究;全反式维甲酸对NPM1突变的白血病细胞系HL-60的作用及其机制探讨

摘要

第一部分iASPP过表达对造血干祖细胞自我更新的影响以及抗凋亡作用的研究
　　 目的:iASPP是p53凋亡诱导蛋白家族(ASPP)的一个抑制性成员，对p53的凋亡功能起负性调控作用。本研究使用实验室前期已成功建立的iASPP转基因(iASPPTg)小鼠模型，探讨iASPP过表达对造血干祖细胞(HSPC)自我更新以及抗凋亡作用的影响。
　　 内容:iASPP作为一个抗凋亡基因，在造血系统中过表达，将导致造血异常。我们实验室前期研究发现在急性白血病(AL)病人中iASPP的表达显著高于正常对照组，为了研究iASPP对正常造血的影响，实验室建立了在小鼠造血组织中特异性高表达iASPP的转基因(iASPP Tg)小鼠模型。本实验应用该小鼠模型，研究iASPP过表达对HSPC数目以及功能的影响，以及iASPP Tg小鼠中造血干细胞细胞周期改变以及细胞凋亡和损伤的情况。
　　 方法:用多色流式细胞仪分析小鼠骨髓单个核细胞(BMMNC)中各个HSPC群的比例改变;使用体内连续移植以及体外连续集落接种的方法研究iASPP Tg小鼠HSPC自我更新和造血重建潜能的改变;使用AnnexinⅤ和PI标记以及流式分析方法研究电离辐射和VP16药物处理两种凋亡诱导方式引起的iASPP Tg小鼠和野生型小鼠骨髓造血干细胞以及BMMNC的凋亡比例;使用Western blot和免疫荧光方法检测电离辐射引起的小鼠BMMNC中γ-H2AX的表达情况;使用siRNA干扰技术结合VP16药物处理检测iASPP Tg小鼠中BMMNC的抗凋亡作用对p53的依赖性;使用小鼠表达谱芯片技术分析iASPP过表达对基因表达和信号通路的影响，为后续研究iASPP的作用机制打下基础。
　　 结果:多色流式分析的结果显示，iASPP Tg小鼠中各群HSPC的比例均比野生组小鼠高:以造血干细胞、长期造血干细胞、多潜能祖细胞、共同髓系祖细胞和粒-单系祖细胞比例增加最为明显(p＜0.05)，而短期造血干细胞和巨核-红系祖细胞比例增加不明显(p＞0.05);体内连续移植显示iASPP Tg组各代受体小鼠体内的造血干细胞数目在1个月的时候始终高于野生组，体外连续集落形成实验也证明在第2代和第3代中，iASPP Tg组的集落数目远远超过野生组;照射和VP16处理两个实验都显示iASPP Tg小鼠骨髓造血干细胞以及BMMNC的凋亡比例明显低于野生组小鼠;Western blot和免疫荧光分析方法动态检测了照射后iASPP Tg小鼠BMMNC中的γ-H2AX的表达在不同时间点始终高于野生组;应用VP16处理时，可以看到iASPP Tg小鼠的BMMNC的凋亡比例始终低于野生组小鼠，而应用RNA干扰方法，抑制小鼠体内的p53表达后，两组小鼠BMMNC的凋亡比例没有明显差别;小鼠表达谱芯片分析显示iASPP Tg小鼠中的很多与凋亡相关、p53通路以及癌症发生相关的通路发生改变。
　　 结论:以上结果第一次证明了抗凋亡调节因子iASPP能够增加造血干/祖细胞的数目，并增强其造血重建的能力。更为有意义的是，iASPP能够保护细胞抵抗凋亡，这些受到凋亡损伤而保留下来的细胞，其细胞修复并没有相应增加，因而随着时间的推移，细胞内累积的损伤越来越多，最终将会引起基因组的不稳定，导致恶性转化，肿瘤发生。
　　 第二部分全反式维甲酸对NPMl突变的白血病细胞系HL-60的作用及其机制探讨
　　 目的：急性髓系白血病(AML)病人中，NPMl突变(NPMlc+)的预后较NPMl野生型的预后好。近年，国外有临床试验报道在联合化疗中加入全反式维甲酸(触限A)，NPMlc+AML病人的预后以及生存期明显提高。本实验的目的是将突变型NPMl导入白血病细胞中，观察细胞的增殖、凋亡、周期以及对ATRA药物的反应等生物学特性，进一步探讨NPMl突变在白血病中的作用及相关机制，以及NPMl突变对ATRA的药物反应，为临床用药提供依据。
　　 方法：采用PCR方法从质粒载体GM-NPMlwt(野生型NPMl)和GM.NPMlmutA(A型突变NPMl)扩增目的片段NPMlwt和NPMlmutA，连接到MSCV-IRES.GFP逆转率病毒载体上，采用磷酸钙共沉淀法转染293T细胞，包装病毒，感染人白血病细胞系HL-60细胞，根据绿色荧光强度筛选出GFP高表达的单克隆细胞，继而通过RQ.PCR、allel.specificPCR和Western blot筛选出目的蛋白高表达的单克隆。采用MTT法检测细胞的增殖活性。采用流式细胞仪技术检测单克隆细胞经ATRA处理后细胞周期、分化和凋亡的改变。采用甲基纤维素半固体培养基测定ATRA处理后各单克隆细胞的集落形成能力的改变。
　　 结果：成功筛选出稳定表达NPMlwt和NPMlmutA的HL-60单克隆细胞。检测这些单克隆细胞的生物学特性和对ATRA的药物反应，结果显示：(1)细胞增殖：与空载体相比，NPMlmutA没有明显改变HL．60细胞的增殖活性(p>0.05)；(2)细胞周期：与空载体相比，NPMlmutA降低细胞的G0/G1期的比例(p<0.05)，增加S期的比例(p<0.05)，当用ATRA处理后，这种差距更加明显(p<0.05)；(3)集落形成：NPMlmutA增强细胞的集落形成能力(p<0.05)，并能够被ATRA明显抑制(p<0.05)；(4)细胞分化：NPMlmutA降低细胞的分化，且对ATRA的诱导分化具有抵抗能力(p<0.05)；(5)凋亡：NPMlmutA能稍微增加HL．60细胞的基础凋亡，但无统计学差异。当用ATRA处理3天后，NPMlmutA能够明显增加细胞的凋亡比例(p<0.05)。
　　 结论：NPMlmutA能够明显增加HL-60细胞的集落形成能力，降低HL-60细胞的基础分化。ATRA处理能明显抑制NPMlmutA的HL-60细胞的集落形成能力；NPMlmutA能够增加HL-60细胞对ATRA的凋亡敏感性，但NPMlmutA对ATRA的分化诱导具有明显的抵抗能力。因此，ATRA治疗NPMl突变的白血病细胞，可能是通过增加细胞凋亡和降低细胞增殖而发挥作用。
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　
　　

目录

第一部分 iASPP过表达对造血干祖细胞自我更新的影响以及抗凋亡作用的研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 全反式维甲酸对NPM1突变的白血病细胞系HL-60的作用及其机制探讨

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述

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