血浆HDL中蛋白质组分与冠心病的关系及应用他汀类药后的变化研究

摘要

一、研究背景
　　 近年来已经对高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)蛋白质组分的含量及变化情况进行了研究。结果表明:冠心病（coronary heart disease，CHD）患者的HDL蛋白质组成发生变化，联合应用他汀类药物+烟酸后，CHD患者的HDL蛋白质组成趋向于“正常化”。不过，该领域的研究尚少，结果差异较大，验证性工作不足，有必要开展进一步的研究工作。
　　 本实验室前期应用蛋白质组学技术比较了CHD患者与非CHD患者（对照组）之间的HDL蛋白质组差异，发现与对照组相比，CHD组HDL中的载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）水平显著下降，血清淀粉样蛋白A(serum amyloid Aprotein，SAA)水平显著升高，但是尚缺乏较大样本的验证性研究。目前国内外尚未报道单独应用他汀类药物治疗冠心病患者前后HDL蛋白质组的变化，且研究已显示他汀类药物可与HDL之间存在功能的相互作用，机制并不十分清楚。因此，本研究拟从两方面进行研究:①，验证上述实验室前期获得的结果，探讨HDL中SAA和apoA-I蛋白水平的变化及与冠心病的关系;②,采用蛋白质组学技术比较他汀类药物使用前后HDL组分的变化，以探讨CHD患者在服用他汀类药物的调脂治疗过程中HDL蛋白组分是否有变化，这种变化是否与患者的疗效有关。同时也希望从另一角度即HDL组分的变化来探讨他汀类药物的作用机制。
　　 二、研究内容：
　　 第一部分冠心病患者血浆HDL中apoA-I与SAA组分变化的研究
　　 1.研究目的：
　　 比较CHD患者与非CHD患者（对照组）血浆HDL中apoA-I与SAA组分差异。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究对象:
　　 2.1.1 CHD组:至少有一支冠状动脉狭窄大于50％，未服用调脂药;
　　 2.1.2对照组:排除CHD，且年龄、性别与CHD组相匹配;
　　 2.2样品收集与HDL分离:收集空腹血浆，应用溴化钾超高速离心方法分离血浆中的HDL;
　　 2.3 ELISA法检测血浆及其HDL中的apoA-I和SAA的水平;
　　 2.4统计学分析:pearson相关性分析研究血浆及HDL中apoA-I和SAA的相关性;logistic回归分析研究血浆及HDL中这两种蛋白与CHD的关联程度。
　　 3.研究结果：
　　 3.1 HDL中apoA-I和SAA水平变化
　　 3.1.1 CHD组(n=67)与对照组(n=67)相比，HDL-apoA-I水平降低，差异有统计学意义（7.80±3.32g/mL vs.10.42±5.51 g/mL，P=0.001）;校正可能的混杂因素后，其在两组间的显著性差异消失(B=-0.109，P=0.088)。
　　 3.1.2 CHD组与对照组相比,log(HDL-SAA)显著升高，差异有统计学意义（1.39±0.58 vs.1.15±0.46，P=0.011）;校正可能的混杂因素后，其在两组之间的差异仍有统计学意义(B=1.738，P=0.017)，且log(HDL-SAA)每升高一个单位，CHD的发生风险升高4.685倍(OR=5.685，95％CI:1.371，23.581)。
　　 3.2血浆中apoA-I和SAA水平变化
　　 3.2.1 CHD组(n=67)和对照组(n=67)相比，plasma-apoA-I的差异无统计学意义(0.7±0.33 g/mL vs.0.79±0.28g/mL， P=0.122)。
　　 3.2.2 CHD组和对照组相比，log(plasma-SAA)水平升高，差异有统计学意义（1.13±0.54 vs.0.88±0.48，P=0.005）;校正可能的混杂因素后，其在两组之间的差异仍有统计学意义(B=1.646，P=0.038)，且log(plasma-SAA)每升高1个单位，CHD的发生风险升高4.185倍(OR=5.185，95％CI:1.095，24.544)。
　　 3.3 pearson相关性分析:在对照组及CHD组的血浆及HDL中apoA-I与SAA的相关系数均无统计学意义。
　　 4.第一部分研究结论
　　 4.1与对照组相比，CHD患者HDL蛋白质组成发生改变:SAA水平明显升高，apoA-I有下降趋势。
　　 4.2血浆中apoA-I在两组之间无明显差异;CHD组血浆SAA明显升高。提示HDL及血浆中SAA均为CHD的危险因素。
　　 第二部分冠心病患者服用他汀类药物后血浆HDL蛋白质组分变化的研究
　　 （一）冠心病患者服用他汀类药物前后血浆HDL蛋白质组成变化的比较
　　 1.研究目的：
　　 探索CHD患者服用他汀类药物前后HDL蛋白质的组成及各组分水平的差异。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究对象:
　　 2.1.1CHD组(n=9);至少有一支冠状动脉狭窄大于50％，入组时未服用他汀等调脂药，参加随访;
　　 2.1.2对照组(n=10):排除CHD，且年龄、性别与CHD组相匹配;
　　 2.2样品的收集与分离:收集CHD组服用他汀类药物半年前后（药前组、药后组）及对照组的空腹血浆;溴化钾超高速离心法分离HDL样品;
　　 2.3 iTRAQ-LC-MS技术:研究药前组、药后组及对照组之间HDL蛋白质组成及各组分水平的相对定量;
　　 2.4 Gene Ontology(GO)功能分析:利用GO功能分析鉴定到的蛋白质分子功能、参与的生物过程及细胞组成分布的特点;
　　 2.5蛋白质聚类分析:三组之间HDL组分差异水平特点。
　　 3.研究结果：
　　 3.1在药前组、药后组和对照组的HDL鉴定出196种高置信度的蛋白质组分。
　　 3.2 GO分析发现这些蛋白具有多种分子活性，参与多种生物学过程。
　　 3.3聚类分析显示CHD患者服用他汀类药物前与对照组HDL蛋白水平之间的差异大于CHD患者药后与对照组HDL蛋白水平之间的差异。
　　 3.4 CHD患者药前药后比较发现14种差异蛋白;在CHD组与对照组之间发现13种差异蛋白;其中serum amyloid A2 isoform(SAA2)、complement C5 preproprotein和histone H1.0三种蛋白的变化趋势均表现为在CHD组显著升高，服用他汀类药物后其在HDL中的含量显著下降，下降水平接近对照组。
　　 4.研究小结：
　　 4.1在CHD药前、药后和对照组的HDL中共鉴定出196种高置信度的蛋白质组分;
　　 4.2GO分析发现这些蛋白具有多种分子活性，参与多种生物学过程;
　　 4.3聚类分析显示CHD患者服用他汀类药物前与对照组HDL蛋白水平之间的差异大于CHD患者药后与对照组HDL蛋白水平之间的差异。
　　 4.4 CHD患者药前药后比较发现14种差异蛋白;在CHD组与对照组之间发现13种差异蛋白;其中serum amyloid A2 isoform(SAA2)、complement C5 preproprotein和histone H1.0三种蛋白的变化趋势均表现为在CHD组显著升高，服用他汀类药物后其在HDL中的含量显著下降，下降水平接近对照组
　　 （二）冠心病患者服用他汀类药物前后血浆HDL中SAA差异水平的变化
　　 1.研究目的：
　　 比较CHD患者服用他汀类药物前后HDL中SAA的水平，初步验证iTRAQ-LC-MS中发现的候选差异蛋白SAA2的水平。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究对象:
　　 2.1.1 CHD组(n=44);至少有一支冠状动脉狭窄大于50％，入组时未服用他汀等调脂药，参加随访;
　　 2.1.2对照组(n=45):排除CHD，且年龄、性别与CHD患者相匹配;
　　 2.2样品的收集与分离:收集CHD组服用他汀类药物半年前后（药前组、药后组）及对照组的空腹血浆;溴化钾超高速离心法分离HDL样品;
　　 2.3 ELISA法检测:CHD药前组与药后组HDL样品中SAA水平。
　　 3.研究结果：
　　 与药前HDL中log(HDLSAA)的水平相比，CHD患者服用他汀类后HDL中的SAA水平明显下降（1.28±0.51 vs.1.01±0.51，P=0.014），与iTRAQ结果一致。
　　 4.研究小结：
　　 他汀类药物可显著下调HDL中SAA的水平。
　　 （三）服用他汀类药物与未服用他汀类药物的冠心病患者血浆HDL中SAA差异水平的研究
　　 1.研究目的：
　　 比较服用他汀类药物半年的CHD患者与未服用他汀类药物的CHD患者血浆HDL中SAA的水平，再次验证iTRAQ-LC-MS中鉴定的候选差异蛋白SAA2水平。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究对象:
　　 2.1.1 CHD用药组(n=65):至少有一支冠状动脉狭窄大于50％，入组时已经规律服用他汀类药物半年左右，未合并使用其他调脂药;
　　 2.1.2CHD未用药组(n=67):至少有一支冠状动脉狭窄大于50％，未服用任何调脂药;
　　 2.2样品收集与HDL分离:收集空腹血浆;超高速离心分离HDL样品;
　　 2.3 ELISA法检测:CHD用药组与CHD未用药组HDL样品中SAA水平;
　　 2.4统计学分析:利用协方差分析的方法校正两组之间的基线差异。
　　 3.研究结果：
　　 3.1CHD用药组HDL中的log(HDL-SAA)水平与CHD未用药组相比，显著下降(1.34±0.58 vs.1.04±0.46, P=0.0002)。
　　 3.2校正总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、apoA-I、载脂蛋白B、肌酐、血糖及高敏C反应蛋白的水平差异后，log(HDL-SAA)在两组之间的差异仍有统计学意义(P=0.005)。
　　 3.3进一步校正HDL-C的水平，log(HDL-SAA)在两组之间的差异仍有统计学意义(P=0.015)。
　　 4.研究小结：
　　 HDL中的SAA水平与CHD患者服用他汀类药物有关。
　　 三、结论：
　　 1.CHD患者HDL蛋白质组成发生改变:其中SAA水平明显升高，apoA-I有下降趋势。SAA为CHD的危险因素。iTRAQ技术又新发现CHD组与对照组之间有13种差异蛋白（6种在CHD组HDL中上调，7种下调）。
　　 2.CHD患者他汀药治疗后，SAA水平下降至正常水平，且不受其他因素影响。iTRAQ技术又新发现CHD组药后与药前HDL样品中有14种差异蛋白（10种在药后HDL中上调，4种下调）。
　　 3.他汀类调脂药可改变HDL中某些蛋白水平。
　　 4.HDL由多种蛋白质成分组成，可以从HDL蛋白组成研究HDL所具有的生物学功能。

目录

缩略语表

主要试验仪器

摘要

前言

第一部分 冠心病患者血浆HDL中apoA-Ⅰ与SAA组分变化的研究

一、研究背景

二、研究目的

三、研究方法

四、研究结果

五、讨论与结论

第二部分 CHD患者服用他汀类药物后HDL蛋白质组分变化的研究

一、研究背景

二、研究内容

(一)冠心病患者服用他汀类药物前后血浆中HDL蛋白质组成变化的比较

(二)冠心病患者服用他汀类药物前后血浆HDL中SAA差异水平的变化

(三)服用他汀类药物与未服用他汀类药物的冠心病患者血浆HDL中SAA差异水平的研究

三、讨论与结论

特色与创新点

结论

参考文献

综述

个人简历

致谢

声明