冠心病患者血浆HDL组分中apoC--I,SAA水平变化及SAA基因多态性研究

摘要

一、研究背景： 传统观念认为高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是冠状动脉粥样硬化心脏病（冠心病）的保护因素，因此HDL-C成为降低心血管事件风险的研究热点。目前临床及相关研究，尤其是药物临床试验，大多以血浆HDL-C水平作为研究对象和评价指标，然而单纯血浆HDL-C水平难以反应其胆固醇的逆转运、抗炎、抗氧化、保护内皮细胞、抑制血栓形成等多效性功能。HDL-C组成具有明显的异质性，其中蛋白质成分是其多效性功能的主要承担者，如载脂蛋白A(apoA-Ⅰ)是胆固醇逆转运功能的主体，抗氧化功能主要与对氧磷酶(PON-1)活性有关等。因此，有必要对HDL中发挥重要生物学功能的蛋白质组分进行研究。研究报道，炎性状态下HDL蛋白组成显著改变，促炎蛋白如血清淀粉酶A(SAA)、补体C3等含量明显升高，使HDL丧失保护功能向促动脉粥样硬化方向发展。既往研究证实，冠心病患者HDL的逆转运功能受损、抗炎能力降低。而冠心病状态下HDL蛋白质组分变化研究尚少，而且蛋白质组学的研究方法不同、结果差异较大，较大样本量研究更少。 本实验室前期应用蛋白质组学iTRAQ技术筛选出冠心病组与非冠心病组HDL中13种差异表达蛋白。由于蛋白质组iTRAQ技术是基于小样本量（n=10/组）的相对定量技术，所以有必要选取代表性的HDL蛋白组分在较大样本中进一步研究。故本研究分别选取与载脂蛋白、炎症、及免疫系统补体相关的三个蛋白:载脂蛋白C-Ⅰ（apoC-Ⅰ）、SAA和补体C5，在稳定冠心病(SCAD)组、急性冠脉综合症(ACS)组和非冠心病（对照组）间进行定量研究，分析三组间HDL蛋白组分差异，为HDL功能改变提供依据，并探讨差异蛋白与冠心病的关系。 我们既往研究提示，冠心病患者血浆及其HDL中SAA均显著升高，并与冠心病风险独立相关。其它研究也证实，血浆SAA与动脉粥样硬化(AS)发生发展相关，可增加急性心血管事件。然而血浆SAA水平检测易受感染、创伤等多种因素影响，因此SAA基因检测预测AS及心血管事件风险有一定的临床应用价值。SAA主要由SAA1和SAA2基因编码，国外研究显示SAA基因突变可影响血浆HDL-C、SAA水平，而SAA基因多态性与AS相关性研究较少，且结果差异较大，国内人群SAA基因多态性相关研究更少。颈动脉内膜中层厚度(IMT)增厚是动脉粥样硬化的早期征象，可作为相关心血管事件的预测指标。本研究拟在中国汉族人群中观察SAA1和SAA2基因多态性的分布情况，分析对血浆HDL-C水平及SAA水平的影响，进一步探讨分别与颈动脉IMT和冠心病的相关性，为临床应用SAA基因检测预测动脉粥样硬化及心血管事件风险提供依据。 二、研究内容及结果： 第一部分冠心病患者血浆HDL组分中apoC-Ⅰ，SAA水平变化研究 1.研究目的： 1.1定量检测SCAD组，ACS组和对照组三组血浆HDL中apoC-Ⅰ、SAA和补体C5三种HDL蛋白组分的表达差异; 1.2定量检测SCAD组，ACS组和对照组三组血浆中apoC-Ⅰ、SAA水平差异，与血浆HDL中的浓度进行相关性分析。 2.研究方法： 2.1研究对象 本研究人群为2011年7月至2012年7月间在阜外心血管病医院就诊的300例未服用调脂药物患者，其中SCAD组65例，ACS组115例，对照组120例;其中SCAD和ACS诊断，均基于冠脉造影证实至少一支冠状动脉狭窄大于50％。 2.2实验室检测： 2.2.1血标本收集及HDL提取:采集空腹静脉血，EDTA抗凝;超高速离心法提取血浆中HDL，65000 r/min，5小时20min; 2.2.2 ELISA方法检测:血浆HDL中apoC-Ⅰ、SAA和补体C5水平;及血浆中apoC-Ⅰ和SAA水平。 3.研究结果： 3.1血浆HDL中apoC-Ⅰ、SAA和补体C5水平差异 3.1.1 HDL-apoC-Ⅰ: ACS组(36.08±9.96μg/mL)和SCAD(37.4±10.33μg/mL)组均显著低于对照组(45.18±7.42μg/mL，P均＜0.001)，多元线性回归校正混杂因素后差异仍存在(F=6.63，P＜0.001);ACS组较SCAD组虽然略下降，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05); 3.1.2 HDL-SAA:三组间log(HDL-SAA)存在显著统计学差异，ACS组(1.53±0.60)和SCAD组(1.32±0.43)显著高于对照组（1.16±0.38，P均＜0.001)，且ACS组显著高于SCAD组(P＜0.01);多元线性回归校正混杂因素后，三组间log(HDL-SAA)仍存在差异(F=18.58，P＜0.001); 3.1.3 HDL-C5: ACS组，SCAD组和对照组三组间HDL-C5水平无统计学差异(2.44±0.65 ng/mL vs.2.38±0.59 ng/mL vs.2.46±0.69 ng/mLP=0.872)。 3.2血浆中apoC-Ⅰ和SAA水平变化 3.2.1 Plasma-apoC-Ⅰ:ACS组（22.62±13.86μg/mL）和SCAD组(24.10±12.48μg/mL)均显著高于对照组(19.37±6.3μg/mL，P=0.028)，但SCAD组和ACS组间无统计学差异(P＞0.05);经Pearson双变量相关性分析显示Plasma-apoC-Ⅰ与HDL-apoC-Ⅰ无统计学相关性(P=0.608); 3.2.2 Plasma-SAA:三组间Log(Plasma-SAA)存在显著统计学差异，ACS组(1.08±063)和SCAD组(0.89±0.50)均显著高于对照组(0.72±0.41，P＜0.001)，且ACS组显著高于SCAD组(P＜0.001)，三组间Plasma-SAA变化趋势与HDL-SAA一致;经Pearson相关性分析显示，Plasma-SAA与HDL-SAA强相关（r=0.80，P＜0.001）。 3.3多因素Logistic回归分析血浆及其HDL中HDL-apoC-Ⅰ和Plasma-apoC-Ⅰ与冠心病相关性 3.3.1 HDL-apoC-Ⅰ和Plasma-apoC-Ⅰ与冠心病风险的相关性:校正可能的混杂因素后，HDL-apoC-Ⅰ与冠心病独立负相关(OR:0.91，95％CI:0.87-0.94，P＜0.001)，HDL中apoC-Ⅰ水平降低可能与冠心病发生风险相关;Plasma-apoC-Ⅰ亦与冠心病独立相关(OR:1.07，95％CI:1.01～1.14，P=0.017)，然而，血浆中apoC-Ⅰ水平升高可能与冠心病发生风险相关; 3.3.2 HDL-SAA和Plasma-SAA与冠心病风险的相关性:校正可能的混杂因素后，HDL-SAA与冠心病独立相关(OR:5.60，95％CI:2.26～13.84，P＜0.001)，HDL中SAA水平升高可能与冠心病发生风险相关;Plasma-SAA亦与冠心病独立相关(OR:2.39，95％CI:1.30～4.41，P=0.005)，血浆SAA水平升高可能与冠心病发生风险相关;HDL-SAA对冠心病风险的预测价值明显高于Plasma-SAA。 4.小结： 4.1冠心病状态下，HDL蛋白组分发生了改变，炎性蛋白SAA显著升高，尤其ACS患者升高显著，载脂蛋白apoC-Ⅰ显著降低。 4.2 HDL-apoC-Ⅰ和Plasma-apoC-Ⅰ对冠心病风险的预测方向相反，HDL中apoC-Ⅰ和血浆中apoC-Ⅰ可能分别发挥不同的作用。 4.3 Plasma-SAA与HDL-SAA在冠心病患者中变化趋势一致，且两者强相关，血浆中SAA水平变化或可推测HDL抗炎功能的变化，作为冠心病的预测指标及治疗靶点。 第二部分 SAA基因多态性与动脉粥样硬化相关性研究 1.研究目的： 1.1观察SAA1(rs11603089)和SAA2(rs1520887，rs2468844，rs7130337，rs7113375)基因多态性位点在中国汉族人群的分布情况; 1.2分析SAA1/ SAA2基因多态性对血浆HDL-C水平的影响; 1.3分析SAA1/SAA2基因多态性分别对血浆及其HDL中SAA水平（Plasma-SAA和HDL-SAA）的影响; 1.4研究SAA1/SAA2基因多态性与颈动脉IMT的相关; 1.5探讨SAA1/SAA2基因多态性与冠心病的相关性。 2.研究方法： 2.1研究对象 本研究人群为2011年7月至2012年7月间在阜外心血管病医院门诊就诊或住院治疗的患者共661例，均为中国汉族人群。其中冠心病患者358例(经冠脉造影证实至少一支冠状动脉狭窄大于50％)，非冠心病患者303例。 2.2实验室检查 2.2.1血浆HDL-C水平测定:所有入组患者(n=661例)均进行血浆HDL-C水平测定，采用美国BECKMAN DxC800全自动生化分析仪进行; 2.2.2 HDL提取及ELISA方法检测SAA:入选人群中有282例患者进行血浆及其HDL中SAA水平检测;超高速离心法提取血浆中HDL; ELISA方法检测血浆及其HDL中SAA水平(Plasma-SAA和HDL-SAA); 2.2.3基因多态性检测:采用MGB-Taqman探针法，ABI7500荧光定量PCR仪对SAA1(rs11603089)和SAA2(rs1520887，rs2468844，rs7130337，rs7113375)进行基因分型检测。 2.3颈动脉内膜中层厚度(IMT)测量:入选人群中有298例患者进行了颈动脉超声检查，采用SIEMENS ACUSON Sequoia512彩色多普勒超声诊断仪，双侧颈总动脉IMT均值为最终的颈动脉IMT。 3.研究结果： 3.1基因分型:在中国汉族人群中，SAA1 rs11603089突变等位基因的发生频率为25.3％;SAA2四个位点rs1520887，rs2468844，rs7130337和rs7113375的突变等位基因的发生频率分别为32.5％，3.0％，28.0％和3.9％;除rs7130337外，其它基因突变位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.005)，均可反映中国汉族人群基因频率分布特征，故不再对rs7130337进一步研究。 3.2 SAA1/SAA2基因多态性对血浆HDL-C水平的影响 3.2.1SAA2-rs1520887位点:野生组(n=299)血浆HDL-C水平显著高于突变组(n=247)，差异有统计学意义(1.15±0.32 mmol/L vs.1.09±0.29mmol/L，P=0.033)，但多元线性回归分析校正可能的混杂因素后，血浆HDL-C水平与SAA2-rs1520887基因突变相关性消失（P＞0.05）; 3.2.2SAA2-rs7113375位点:野生组(n=501)血浆HDL-C水平显著高于突变组(n=45)，差异有统计学意义(1.14±0.31 mmol/L vs.1.00±0.24mmol/L，P=0.004)，多元性行回归校正可能的混杂因素后，血浆HDL-C水平与rs7113375（β=0.12，P=0.003）独立相关; 3.2.3SAA1-rs11603089和SAA2-rs2468844位点:该两个位点的野生组和突变组组间血浆HDL-C水平均无统计学差异(P＞0.05)。 3.3SAA1/SAA2基因多态性对血浆中SAA水平(Plasma-SAA)的影响 3

目录

缩略语表

主要试验仪器

摘要

前言

第一部分 冠心病患者血浆HDL组分apoC-I，SAA水平变化研究

一、研究背景

二、研究目的

三、研究方法

四、研究结果

五、讨论

六、研究小结

第二部分 SAA基因多态性与动脉粥样硬化相关性研究

一、研究背景

二、研究目的

三、研究方法

四、研究结果

五、讨论

六、研究小结

本研究的特色与创新

研究结论

参考文献

血清淀粉样蛋白A(SAA)与动脉粥样硬化相关性研究进展 (综述)

个人简历

致谢

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