登革热抗体依赖性感染增强(ADE)的机制研究

摘要

目的:研究异型登革热病毒(DENV)-抗体复合物感染K562细胞所产生的抗体依赖感染增强作用(ADE)机制。
　　方法:将梯度稀释的Ⅱ型登革热膜前蛋白抗-PrM单克隆抗体与Ⅲ型登革热病毒(MOI=3)于37℃，5％CO2培养箱内孵育90min形成抗体-病毒复合物后感染K562细胞，通过间接免疫荧光染色，Real-TimePCR检测DENV抗原在细胞内的表达增强，然后通过蛋白组学技术发现ADE过程中K562细胞蛋白表达的差异，并通过G-(O)软件对差异蛋白进行归类分析揭示其亚细胞定位和分子功能。然后选择差异显著的蛋白进行WesternBlot验证其在转录水平的表达增强，最后通过RNA干扰，Real-TimePCR研究该蛋白能否降低ADE过程中登革热病毒的表达量。
　　结果:抗体依赖增强作用(ADE)的效果取决于抗体浓度。稀释度为1/2560的抗体与DENV结合共同感染K562后，细胞内登革热病毒抗原的免疫荧光染色结果有明显增强，Real-TimePCR检测的结果也证实了该稀释度的抗体病毒复合物感染K562细胞后登革热病毒数量显著增加。2-D及质谱分析结果发现ADE过程中有15个表达差异显著的蛋白，G(O)分类分析发现差异蛋白主要与蛋白折叠，细胞骨架结构，肌动蛋白微丝进程，调节ATP酶的活性，调节横纹肌，心肌收缩等生物过程相关。其中PFDN1和MYL3蛋白的表达明显增强，WesternBlot结果也证实了这一点。最后选择RNA干扰PFDN1蛋白的表达，Real-TimePCR检测的结果显示干扰PFDN1的表达后在ADE过程中登革热病毒量明显降低。
　　结论:成功建立了登革热病毒的抗体依赖感染增强作用的体外研究模型，发现了ADE过程中病毒表达增强相关的蛋白，为进一步的ADE作用机制的研究及疫苗研发提供理论基础。

目录

摘要

前言

(一)登革热病毒概况

(二)登革热ADE简介

(三)登革热疫苗研究进展

(四)全球登革热流行统计

(五)课题研究目的及意义

一、实验材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、实验结果

1．病毒滴度CCID50测定

2．病毒感染细胞的免疫荧光染色

3．体外ADE的间接免疫荧光染色结果

4．Real-Time PCR

5．二维凝胶电泳结果

6．质谱分析结果

7．差异蛋白质的GO注释和分析

8．Western Blot

9．RNA干扰PFDN1在K562细胞中的表达

10．PFDN1干扰后登革热病毒量的表达

11．根据CCID 50值测定PFDN1-siRNA干扰后病毒滴度

三、讨论

小结展望

参考文献

附录Ⅰ 缩略词

附录Ⅱ 溶液配制

致谢

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