MicroRNAs在乳腺癌和神经细胞发育异常中的作用及分子机制

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一类进化上保守的、在转录后基因调控中发挥功能的非编码小RNAs。MiRNAs的一个关键作用是通过碱基不完全互补的方式与其靶mRNA的3'非翻译端(3'-untranslated Region，3'-UTR)的特定区域相互作用来抑制靶基因的表达。生物体内约1/3的编码蛋白受miRNAs的调节，而每个miRNA估计有大约上百个靶基因。由于miRNA在复杂的基因调控网络中扮演的重要的角色，使其在生命体的生长发育、细胞的分化和凋亡以及人类疾病的发生等生命过程中起着重要的作用。研究miRNAs在疾病中的表达模式和作用机制可能为疾病的诊断和治疗提供新的标志物。
　　 一、miR-101和miR-185在乳腺癌发生中的分子作用机制
　　 近年来，越来越多的数据表明，miRNAs的异常表达与肿瘤的发生和发展有着密切联系。miRNAs在许多类型的癌症中存在着异常的表达图谱，如肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠癌等，提示了miRNAs可能扮演癌症基因或抑癌基因的角色。我们实验室曾利用候选基因筛查的方法以人乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织为研究对象筛选在乳腺癌发生中差异表达的miRNAs，发现miR-101和miR-185存在差异表达。我们分别研究了它们在乳腺癌发生中的作用。
　　 我们发现了miR-101在三阴、三阳、ER/PR阴性和HER2阳性以及ER/PR阳性和HER2阴性的乳腺癌样本中，发生了显著的下调。miR-101表达上调后，能够抑制乳腺细胞的增殖、迁移和浸润，促进细胞的凋亡;而表达下调后，对细胞的生长和转移等产生相反的影响。进一步的研究表明，miR-101和Stathmin1(Stmn1)的表达呈显著的负相关。miR-101能够结合在Stmn1的3'-UTR进而抑制其翻译。miR-101表达的上调导致对细胞的生长和转移的抑制作用，可以通过Stmn1的过表达而部分恢复。Stmn1的敲除减弱了miR-101介导的细胞生长和转移的增强效应。另外，体内的研究表明，与miR-101的普遍下调相比，Stmn1 mRNA和蛋白水平在不同类型的人乳腺癌组织中发生了显著的上调。
　　 miR-185在三阴、三阳、ER/PR阴性和HER2阳性的乳腺癌样本中，发生了明显的下调。而在ER/PR阳性和HER2阴性的乳腺癌中，发生了略微的下调。我们通过在miR-185表达相对较低的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-453中过表达miR-185，而在表达相对较高的乳腺癌细胞MCF7和T47D中敲低miR-185来研究miR-185在乳腺癌中的作用。结果表明了miR-185表达上调能够抑制细胞的增殖、迁移和浸润，促进细胞的凋亡，反之亦然。同时，我们还验证了血管内皮生长因子a(vascular endothelial growth factor a，Vegfa)是miR-185的靶基因之一。Vegfa的过表达可以部分恢复由于miR-185表达的上调对细胞的生长和转移的抑制作用;而Vegfa的敲除减弱了miR-185介导的细胞生长和转移的增强效应。此外，Vegfa mRNA和蛋白水平在三阴、三阳、ER/PR阴性和HER2阳性的乳腺癌样本中，发生了显著的上调。
　　 综上所述，miR-101和miR-185在不同类型人乳腺癌组织中的表达下调，对乳腺癌细胞存在相似的调节作用，与它们通过各自的靶基因增强细胞的增殖和浸润能力有密切联系，可能为未来临床上对乳腺癌的诊断提供很有价值的线索。
　　 二.miR-206在神经细胞异常发育中的作用及其调控机制
　　 MiR-206是miRNAs家族成员之一。miR-206在骨骼肌的生长和发育中起着重要的作用，。然而，miR-206是否在其他细胞中发挥功能仍不清楚。本实验室在前期工作中，通过对sodium arsenite(SA)处理引起的神经管畸形的鸡胚进行microRNA微阵列分析，发现了miR-206存在差异表达。由此，我们推测miR-206可能在神经细胞异常发育中发挥了重要作用。本研究通过Northern blot分析进一步验证了，SA处理的鸡胚中miR-206发生了差异表达。在神经胶质细胞瘤细胞U343和成神经细胞瘤细胞SK-N-SH中过表达miR-206后，通过MTT、Edu Apollo assay和流式细胞术分析细胞存活能力发现，过表达miR-206抑制细胞增殖，而促进了细胞凋亡;反之亦然。利用生物信息学预测显示orthodenticle homeobox2(Otx2)是miR-206的靶基因。我们将Otx2的3'-UTR与miR-206的模拟物或抑制物共转染细胞，通过双荧光素酶活性分析进一步验证Otx2和miR-206的关系，结果显示荧光素酶活性伴随着miR-206的过表达而显著减弱，伴随着miR-206的敲低而明显增强。这些结果提示了miR-206能与Otx2的3'-UTR相互作用， Otx2可能是miR-206的靶基因。通过western blot和qRT-PCR分析miR-206对内源性Otx2表达的影响发现，miR-206过表达能够下调Otx2的表达，而miR-206的低表达能够提高Otx2的表达水平，从而进一步证实了miR-206与Otx2之间的靶向调控关系。同时，我们利用全胚免疫荧光和western blot，发现了Otx2在SA处理引起的神经管畸形的鸡胚中，也发生了明显的表达下调。这些结果提示了miR-206可能通过调控Otx2的表达来参与调节神经细胞的发育过程。

目录

声明

摘要

第一章 MicroRNAs在乳腺癌发生中的作用及分子机制

第一节 MiR-101在乳腺癌的发生中的作用及分子机制

摘要

实验材料

主要试剂

主要实验仪器

研究方法

研究结果

讨论

小结

参考文献

第二节 MiR-185在乳腺癌发生中的作用及分子机制

摘要

前言

实验材料

主要试剂

主要实验仪器

研究方法

研究结果

讨论

小结

参考文献

第二章 MiR-206在神经细胞异常发育中的作用及其调控机制

摘要

前言

实验材料

主要试剂

主要实验仪器

研究方法

研究结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 MiRNAs在乳腺癌研究中的新进展

综述二 MicroRNAs在神经发育中的功能研究进展及前景展望

缩略语表

个人简历

致谢