第一部分EGF及EGFR基因多态性与HBV感染相关的原发性肝癌的关联研究;第二部分SP1蛋白的原核表达纯化及复性

摘要

第一部分 EGF及EGFR基因多态性与HBV感染相关的原发性肝癌的关联研究
　　 研究背景:肝细胞癌是一种世界范围内普遍发生的恶性实体瘤。与其它癌症相比，它导致的死亡率位居世界第三，是威胁全人类的公共卫生问题。遗传和环境因素在肝细胞癌发生的过程中起着重要的作用。大量的研究表明，宿主细胞内一些重要的细胞因子及其通路的异常是引发疾病的热点。表皮生长因子(EGF)及其受体可以调节表皮细胞和上皮细胞的生长，且表皮生长因子信号通路与胚胎的生长、组织的修复及肿瘤的发生有关。表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜受体，在多种恶性肿瘤中都有过度表达。激活EGFR会加快肿瘤细胞繁殖，促进肿瘤血管生成，加速肿瘤转移和阻碍肿瘤凋亡。本研究采用病例-对照的研究方法，选取了EGF及其受体基因EGFR来探讨它们与HBV感染相关的原发性肝癌的遗传易感性的关联。
　　 方法:本实验选取了中国北方汉族人群共计1826例，其中病例为416例HBV感染相关的肝细胞癌患者，对照分别为765例慢性乙型肝炎患者（对照Ⅰ）和645例未感染过HBV病毒的乙肝五项全阴正常人群（对照Ⅱ）。对EGF和EGFR两基因上MAF＞20％的共8个SNPs位点进行了基因分型来检测它们与肝细胞癌易感性的关联。基因分型实验采用TaqMan法。
　　 结果:位于EGF基因上的rs11569017位点的等位基因频率(P=0.001，OR=1.43，95％CI=1.15-1.79)和基因型分布(P=0.005)在肝细胞癌病例组和对照组Ⅱ中有显著差异。经过递加模型下的logistic回归后，rs11569017位点依然与肝细胞癌发生的易感性相关(P=0.021，OR=1.48，95％CI=1.06-2.07)，其它SNPs位点的等位基因频率和基因型分布在病例和两个对照组中无显著差异。另外，由EGF基因上的rs11569017位点和rs4444903位点构成的单倍型T-G可能会增加罹患肝细胞癌的风险(P=0.002, OR=1.44,95％CI=1.15-1.82)。
　　 结论:位于EGF基因上的rs11569017位点的T等位基因与HBV感染相关的原发性肝细胞癌的遗传易感性相关。
　　 第二部分 SP1蛋白的原核表达纯化及复性
　　 研究背景:肿瘤的发生发展是由各种因素共同作用导致的，其中位于核内的转录因子起着关键作用，SP1(Specifisity Protein1)转录因子是哺乳动物体内普遍表达的转录因子。研究发现，SP1在肺癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤都有高表达，普遍被看作是一个促癌因子。已有明确的研究表明，SP1不仅可以促进血管内皮生长，还可以调节细胞凋亡，其自身的磷酸化程度也可以调节其下游的基因的转录活性。基于SP1蛋白在调节肿瘤相关基因转录活性方面具有重要作用，纯化SP1蛋白对于研究有关基因的转录调控方式将有重要的意义。由于体外表达的SP1蛋白以不溶性的包涵体(inclusionbodies，IBs)形式存在，需要通过变性使其溶解，再用Ni柱纯化，将纯化获得的蛋白溶于8M的尿素，但尿素会使蛋白发生变性，必须去除尿素，而去除尿素会导致蛋白重新沉淀，故需要对蛋白进行复性实验，寻找适宜条件，使变性条件下松弛的肽链重新折叠为具有正确天然构象，获得可溶性SP1蛋白。
　　 研究目的:1，克隆和表达全长的SP1蛋白，以得到纯化的重组蛋白;2，获得有活性的纯化蛋白用于实验室后期对研究SP1转录因子与转录翻译起始区域结合提供条件。
　　 实验方法:从培养的HeLa细胞中提取总RNA，利用RT-PCR的方法得到人SP1基因全序列，构建含有目的片段的T载体，利用PCR、酶切等手段将目的序列克隆到表达载体，目的序列经过测序鉴定后重组的阳性表达质粒命名为SP1-pET28a。将重组的表达质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达。超声碎菌，处理包涵体，在变性条件下纯化蛋白，利用透析除盐并超滤浓缩。蛋白经SDS-PAGE、Western Blot鉴定，Bradford法定量后，EMSA初步验证蛋白活性。
　　 实验结果:1.获得SP1表达载体SP1-pET28a，经测序证实插入序列无误。2.获得体外有生物活性的SP1蛋白。
　　 实验结论:利用pET表达体系可较为简便地在体外表达并获得全长的SP1蛋白，SP1蛋白复性的关键因素在于透析液中是否加入Zn2+。

目录

缩略语表

第一部分 EGF及EGFR基因多态性与HBV感染相关的原发性肝癌的关联研究

摘要

一．前言

二．研究目的和对象

三．实验内容及技术路线

四．实验方法

五．统计分析

六．研究结果

七．讨论

八．小结

参考文献

RNAi技术在肝癌细胞分化相关基因中的研究进展

第二部分 SP1蛋白的原核表达纯化及复性

摘要

一．前言

二．实验内容及技术路线

三．实验方法

四．研究结果

五．讨论

六．小结

参考文献

附录

致谢

个人简历及发表论文

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