蓝藻抗病毒蛋白N基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

摘要

目的:构建蓝藻抗病毒蛋白(CV-N)基因原核表达载体,表达、纯化并复性其重组蛋白.方法:根据GenBank中CV-N的全基因序列,人工合成CV-N序列,进行PCR扩增.将扩增的PCR产物克隆至原核表达载体pET30a(+)上,构建重组表达载体pET30a-CV-N,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达蛋白,SDS-PAGE和Westen blot鉴定表达产物,Ni Sepharose柱纯化目的蛋白,稀释法复性蛋白.结果:重组质粒pET30a-CV-N测序结果显示,插入片段为303 bp,与GenBank中的CV-N基因序列完全相同.经IPTG诱导的CV-N基因可在E.coli中高效表达;SDS-PAGE分析表明,相对分子质量11 000处出现一条新条带,主要以包涵体形式存在,37℃诱导2、4、6、8 h后,表达蛋白分别占菌体蛋白的3.87%、19.10%、33.98%和31.58%.Western blot结果显示,重组蛋白能与抗His单抗特异性反应.将诱导6 h的菌体超声破碎后,Ni Sepharose柱纯化,相对分子质量11 000处显示出清晰的单一条带,且蛋白复性效果良好.结论:成功地构建了CV-N原核表达载体,表达并纯化出重组蛋白,为深入研究其抗病毒的活性奠定了基础.