叶酸受体阳性的循环肿瘤细胞可作为新的肺癌辅助诊断标志物

摘要

肺癌是目前中国和全球最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在中国及全球范围内均居于首位。很多肺癌确诊时已经为中晚期或伴有远处转移，其5年生存率约为15％。由于低剂量螺旋CT等新的诊断技术的应用，肺癌的早期诊断能力得到很大提升。但是低剂量螺旋CT对中央型肺癌以及小肺癌(＜3mm)诊断的假阳性率较高，其临床应用受到一定限制。因此，我们需要进一步发现新的肿瘤标志物来辅助肺癌的早期检测与辅助诊断。 外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指存在于血液循环系统里的肿瘤细胞。目前研究已经证实在早期肿瘤甚至癌前病变的患者外周血中就已经存在CTCs。因此，利用高灵敏的技术检测CTCs具有对肺癌进行早期检测与辅助诊断的潜在价值。 本研究中，我们使用了通过识别肿瘤细胞表面的叶酸受体(folate receptor，FR)来定量检测CTCs的方法，分析了肺癌、肺良性病以及正常人群的外周血中CTCs含量，分析了手术前后肺癌患者外周血CTCs含量的变化，同时检测了食管癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌患者外周血中CTCs的含量，评价了这一FR阳性CTCs检测方法在癌症早期检测、辅助诊断及复发监测中的潜在应用价值。该方法的基本原理为:在获得3mL患者血样后，应用CTCs富集纯化系统去除样品中的红细胞和绝大多数白细胞并将样品中剩余的稀有细胞包括CTCs进行富集。然后用特异性小分子探针对CTCs表面高表达的FR进行标记和鉴别。最后利用特异性引物，结合Taqman探针，采用聚合酶链式反应技术，对循环肿瘤细胞结合的小分子探针进行定量检测，通过比对标准曲线从而评估得出样品中循环肿瘤细胞的含量。 我们一共入组符合要求的肺癌患者308例（包括非小细胞肺癌296例，小细胞肺癌12例），正常人107例，肺良性病患者102例。检测结果显示，正常人组CTCs水平为5.71[3.7-8.68]单位，肺良性病组CTCs水平为6.47[4.78-7.83]单位，肺癌组CTCs水平为10.51[7.5-15.55]单位。使用Mann-Whitney U检验发现，肺癌组的CTCs水平高于正常人组与肺良性病组(p＜0.001);其中，Ⅰ期肺癌（138例）患者CTCs水平为9.93[7.03-14.41]单位，也明显高于正常人组及肺良性病组，差异有统计学意义(p＜0.001)。而肺良性病组与正常人组之间CTCs水平差异无统计学意义(p=0.132)。 在肺癌组患者中，我们发现原发肿瘤最大径＞3.4cm的患者，其外周血CTCs水平高于最大径≤3.4cm的患者(p=0.043)。Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者外周血CTCs水平高于Ⅰ-Ⅱ期患者(p=0.034)。在不同的病理学亚型中，鳞状细胞癌与小细胞癌患者外周血CTCs水平明显高于腺癌患者(p=0.002)。 接下来，我们评价了FR阳性的CTCs检测方法进行肺癌辅助诊断的潜在价值。以全部肺癌患者作为病例组，正常人及良性疾病患者作为对照组，绘制ROC曲线，曲线下面积为0.781(95％CI:0.743-0.816)。利用尤登指数来寻找最佳截点值，当敏感性+特异性-1达到最大值时，此时CTC值为8.5。取8.5个单位作为截点值来进行诊断，此时全部肺癌患者的诊断敏感性为68.8％，特异性为79.4％。其中，Ⅰ期肺癌患者的诊断敏感性为65.2％。与现有临床常用的NSE，CEA，CA125，cyfra21-1，SCC Ag五种肺癌血液诊断标志物比较，FR阳性CTCs的诊断效率均高于这五种诊断标志物。 在308例肺癌患者中，我们收集到了44例术前CTCs检测阳性的患者的术前和术后血样，检测发现这44例肺癌患者术前外周血CTCs水平为13.41[11.11-17.35]单位，术后外周血CTCs水平为6.65[4.07-9.84]单位，两者差异具有统计学意义(p＜0.001)。 最后，我们进一步检测了食管癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌五种恶性肿瘤患者外周血中FR阳性CTCs的水平。结果显示，食管癌组患者CTCs水平为8.5[4.76-9.87]单位、乳腺癌组CTCs水平为7.37[5.35-9.43]单位、结直肠癌组CTCs水平为8.08[5.4-10.33]单位、胃癌组CTCs水平为6.51[5.17-10.02]单位、肝癌组CTCs水平为6.84[4.93-9.12]单位。利用非参数检验发现结直肠癌组(p=0.007)、乳腺癌组(p=0.013)、胃癌组(p=0.049)的CTCs水平高于正常人群，而肝癌组(p=0.163)、食管癌组(p=0.063)的CTCs水平与正常人群无明显差异。 通过该研究，我们确认了FR阳性的CTCs检测可以作为肺癌患者辅助诊断和早期检测的潜在分子标志物。在手术切除肿瘤之后，肺癌患者外周血CTCs水平会出现明显下降，提示了这一方法在术后复发监测中的价值。此外，FR阳性的CTCs检测在胃癌、乳腺癌和结直肠癌患者中也有一定的临床价值，需要大样本研究来进一步证实。

目录

表索引

图索引

中英文缩略词表

摘要

前言

一、肺癌的流行病学研究

二、肺癌的循环肿瘤细胞研究进展

材料与方法

一、临床研究的伦理审查

二、外周血样本收集流程

三、研究对象及其血样的入选标准、排除标准和剔除标准

1) 肺癌患者外周血中CTCs的检测研究中受试者的筛选标准(分为病例组及对照组)

2) 肺癌患者围手术期外周血中CTCs的动态检测研究中的受试者筛选标准

3) 其他恶性肿瘤患者外周血中CTCs的检测研究中的受试者筛选标准

四、研究对象资料

五、实验设备

六、CTCs检测方法

1) 样本处理部分

2) 荧光定量PCR仪检测

3) 实验结果分析

七、细胞免疫荧光实验

八、统计学方法

结果

一、验证CTCs

二、在肺癌患者中检测外周血CTCs意义的研究

1) 肺癌患者的基本临床、病理资料

2) 正常人和肺部良性疾病患者临床资料

3) 正常人、肺良性病及肺癌组中外周血中FR阳性的CTCs水平

4) 肺癌患者FR阳性CTCs水平与临床、病理因素之间的关系

5) ROC分析

6) FR阳性CTCs与现有血液辅助诊断标志物的比较

三、肺癌患者围手术期外周血FR阳性CTCs的变化

四、其他恶性肿瘤患者外周血中FR阳性CTCs的水平

讨论

小结

参考文献

基金资助

在学期间发表论文

文献综述 肺癌循环肿瘤细胞的研究进展

致谢

个人简历

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