长链非编码RNA-HOTIRM1、TP53TG1在人神经胶质瘤中的表达分析以及与糖代谢关系的初探

摘要

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一种内源性、长度超过200个核苷酸、不编码蛋白的转录物。随着转录组测序的进步，越来越多的证据表明长非编码RNA在细胞生物学中参与多重层次的调控功能，包括在表观遗传水平，转录水平，以及转录后水平调控基因的表达。具体作用方式包括:参与组蛋白修饰复合物的组装过程，促进激素信号传导通路的激活，参与mRNA的转录后加工过程如剪接，通过同源区域与mRNA产生直接相互作用而介导mRNA的降解，与miRNA竞争性结合靶mRNA而阻碍miRNA行使功能等。
　　 lncRNA可以影响肿瘤中的抑癌信号通路。如HOX transcript antisense RNA(HOTAIR)在乳腺癌、肝癌和结肠癌中表达异常，通过将Polycomb抑制复合物2(Polycomb Repressive Complex2，PRC2)招募到抑癌基因座位上，抑制抑癌基因的表达，从而促进肿瘤增殖并抑制凋亡。另外，在DNA损伤等应激状态下，P53可以直接诱导taurine upregulated1(TUG1)等lncRNA的表达，这些lncRNA通过与蛋白相互作用，调控与细胞周期相关基因的表达。
　　 肿瘤具有独特的能量代谢特征。肿瘤细胞的生长增殖需要充足的物质和能量来维持，通过以下途径实现:1）增加对糖、谷氨酰胺的摄取;2）依赖糖酵解供能，而不是氧化磷酸化，即具有瓦伯格(Warburg)效应;3）合成更多的ATP、脂类、氨基酸和核酸;4）改变糖代谢过程中关键酶的活性等。
　　 2012年，香港大学的研究人员利用lncRNA芯片，在两组人神经胶质瘤临床样本（一组268例，另一组独立样本157例作为验证）中筛选差异表达的lncRNA。对比正常脑组织，研究人员发现129条lncRNA在胶质瘤组织中表达差异高于2倍。我们希望从中寻找对胶质瘤细胞糖代谢起重要作用的lncRNA，选取HOXA反义转录物髓系异构体1(HOXA transcript antisense RNA，myeloid-specific1，HOTAIRM1)和TP53靶基因1(TP53 target1，TP53TG1)作为研究对象。
　　 首先，我们利用Real time PCR分析HOTAIRM1和TP53TG1在人正常神经胶质细胞以及胶质瘤细胞中的表达情况。结果表明:HOTAIRM1在人神经胶质瘤细胞系中表达水平较高，TP53TG1在人正常胶质细胞中表达水平较高。
　　 然后，我们构建了HOTAIRM1和TP53TG1的全长表达克隆及真核表达载体。并进一步探究了过表达HOTAIRM1和TP53TG1对细胞存活的影响。同时，利用Real time PCR检测HOTAIRM1和TP53TG1对神经胶质瘤细胞中一系列参与调控肿瘤糖代谢的关键基因mRNA水平的影响。MTT结果显示:HOTAIRM1和TP53TG1可以在一定程度上促进入神经胶质瘤细胞U87MG的存活。Real timePCR结果显示:HOTAIRM1可以在mRNA水平上调葡萄糖相关蛋白78（glucose-regulated protein，78kDa, GRP78）、己糖激酶2(hexokinase2，HK2)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)、异柠檬酸脱氢酶1(isocitratedehydrogenase1，IDH1)、异柠檬酸脱氢酶2（isocitrate dehydrogenase2，IDH2）、延胡索酸酶（fumarate hydratase，FH）、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenasecomplex，SDH)的表达，下调丙酮酸激酶2(Pyruvate kinase M2，PKM2)的表达。TP53TG1可以在mRNA水平上调GRP78、HK2、丙酮酸激酶1(Pyruvate kinaseM1，PKM1)、LDHA、IDH1、IDH2、FH的表达，下调PKM2的表达。以上的研究结果为探讨HOTAIRM1和TP53TG1在神经胶质瘤中的生物学功能奠定了基础。

目录

摘要

前言

技术路线

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

不足与展望

参考文献

综述

附录

个人简历

致谢

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