1.心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在临床前心脏毒性评价中的应用;2.豚鼠镍过敏性接触性皮炎模型的建立

摘要

第一部分:心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在临床前心脏毒性评价中的应用 药物研究从设计到上市的整个阶段，毒性反应是导致其研发失败的最主要原因。即使上市后仍有许多药物由于出现研发阶段未能发现的毒性反应而被撤市或严格限制使用。药物的心血管毒性占其全部毒性反应的26％。随着基因组学、分子生物学等学科的迅速发展，每年都有新增的化合物进入新药研发阶段，这必然要求在临床前研究阶段对其心血管毒性进行灵敏、快速、准确及实用的筛选与评价，及早发现心血管毒性，提高新药研发的成功率，减少研发成本。目前，用于药物毒性评价的模型有两大类:一类是以细胞、组织为代表的体外评价模型，但其不能反映动物的新陈代谢和整体生理过程。另一类是以啮齿类为代表的哺乳动物体内评价模型，可从整体水平直观地反映药物的毒性作用，但需要牺牲大量的动物为代价，并且敏感性也有待提高。由于以上两种方法具有各自的局限性，越来越多的人在探索更特异、灵敏的安全评价模型。转基因动物模型是目前研究的热点;这一目的性的基因导入，有望控制某一药物的代谢或亲和力，为提高检测的敏感性提供可能。 CYP2E1为亚铁血红素类蛋白质超家族酶系，对内、外源性物质的代谢失活或活化起关键作用，在药理学和毒理学应用中具有十分重要的地位。其主要表达在肝脏微粒体。两种心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠(心脏特异性CYP2E1转基因小鼠(α-MHC CYP2E1 transgenic mice，Tg)和心脏特异性CYP2E1基因沉默小鼠(α-MHC CYP2E1 silence mice，sTg)）是心脏特异性干预CYP2E1基因表达的基因修饰小鼠模型。心脏特异性CYP2E1基因的改变能影响心脏组织内CYP2E1基因底物的代谢和转移，从而影响这些底物对心脏的作用。人类疾病的转基因动物模型具有与人类疾病在致病原因、机制方面的相同点，已被越来越多的科研人员应用于药物评价中。本研究分别利用CYP2E1基因的特异性底物对乙酰氨基酚(APAP)和心脏特异性累积毒性药物阿霉素(DOX)，对两种基因修饰小鼠Tg和sTg作为心脏毒性评价模型的特异性和灵敏度进行评估。 首先，Tg和sTg两种基因修饰小鼠分别与C57BL/6交配繁殖，并收集小鼠的出生情况;PCR方法检测鉴定阳性小鼠，并计算阳性率。以满足以下两个实验的动物需求。并收集小鼠的生长情况信息。为之后的研究提供基础数据。 其次，以Tg和sTg两种基因修饰小鼠与C57BL/6小鼠为实验对象，利用CYP2E1基因的特异性底物APAP400mg/kg单次灌胃给药，血生化检测小鼠心脏、肝脏、肾脏功能指标(CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、UN、CREA)。评价该基因的心脏特异性表达，是否更易诱发CYP2E1基因相关的心脏毒性反应。 再次，本研究以能在心脏组织特异性累积、已知心脏毒性并为之受到限制使用的药物阿霉素(DOX)为受试药物，5mg/kg隔天一次共5次（累积剂量25mg/kg）腹腔注射给予不同月龄的Tg和sTg小鼠，通过对转基因小鼠形态观察、血生化测定评价药物的心脏毒性作用特征，对这两种转基因小鼠心脏毒性评价模型的有效性进行验证。并比较性别、年龄等对模型的影响。 结果显示，Tg和sTg两种基因修饰小鼠都能稳定地遗传转入的外源基因。但两种基因修饰小鼠阳性率都低于理论值50％，分别为Tg41.8％、sTg34.7％。其生长情况与野生型的C57BL/6小鼠无差异。APAP400mg/kg单次灌胃给药后，给药组小鼠均出现严重的肝损伤(ALT、AST、LDH等明显升高)。而其心脏毒性只在CYP2E1表达沉默的sTg小鼠中明显降低。而DOX给药组中心脏毒性指标AST、LDH、CK、CK-MB均明显增高，且Tg给药组明显高于sTg给药组。同时发现性别、年龄等均不影响DOX的心脏毒性作用。 本研究结果提示心脏特异性CYP2E1转基因小鼠(α-MHC CYP2E1 transgenicmice，Tg)由于转入的CYP2E1基因在小鼠心脏组织高表达，使心脏组织易于受到外界的干扰而损伤，从而对有潜在心脏毒性的药物的心脏毒性评价更敏感。可以用于评价具有潜在心脏毒性的药物。其更多的适应性需要进一步研究。 第二部分:豚鼠镍过敏性接触性皮炎模型的建立 镍是一种最容易导致过敏的金属。随着镍合金的广泛应用，镍变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)的发病率不断增高。该病主要的临床表现为皮肤红肿、瘙痒、水疱等。镍ACD是一种Ⅳ型变态反应，在该疾病的发病过程中，多种细胞因子起着重要的作用，参与超敏反应的发病过程。然而有关镍ACD的动物模型，却鲜有与该病临床发病过程和病理表现相一致的动物模型。本研究就这一问题建立动物模型。建立与临床发病过程及病理表现相一致的豚鼠镍变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)模型，并观察不同致敏条件（镍浓度、致敏时间、汗液和接触时间）对造模的影响，为临床前评价镍ACD治疗药物提供动物模型。 86只豚鼠分为14组，采用“9天”和“28天”的致敏方案分别以10％、20％的硫酸镍进行豚鼠腹部皮肤封闭涂抹致敏，以5％硫酸镍溶液封闭涂抹致敏同一部位进行激发。并根据不同的封闭接触时间(6h或12h)及人工汗液干扰建立不同皮肤反应程度的镍过敏接触性皮炎动物模型。激发后6h、12h、24h、48h和72h记录豚鼠激发部位皮肤反应（红斑、水肿）;分别采集“9天”方案致敏的豚鼠24h、48h和72h的皮损组织，匀浆后测定皮损组织中IL-2和INF-γ含量;同时HE染色检测皮损组织病理改变。 结果表明:①“28天”激发组，激发后各组激发部位皮肤48h时红斑程度最强，并于48后红斑程度减轻，而“9天”激发组中，红斑在24h程度最强并一致持续到72h;豚鼠皮损皮肤水肿均不明显。②“9天”激发后皮损部位皮肤组织中IL-2和IFN-γ均在24 h达到峰值并持续到72h，峰值分别为(533.53±41.51)pg/ml和（1235.63±76.85）pg/ml。③激发部位皮肤表面结痂，表皮增厚，轻度角化过度，真皮毛细血管扩张，真皮及表皮内有炎性细胞浸润，与人类ACD病理表现一致。 结论“9天”的致敏方案能建立皮肤反应较严重的ACD模型，并通过增加镍浓度、封闭接触时间以及人工汗液控制变态反应程度;本研究为研究镍ACD提供与临床相似的各种豚鼠ACD动物模型。

目录

第一部分：心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠在临床前心脏毒性评价中的应用

摘要

引言

1．转基因动物在毒理学中的应用

2．心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠

3．心脏损害的生物标记

4．药源性心脏毒性

5．本文研究目标及主要内容

一．心脏特异性CYP2E1基因修饰小鼠的繁育

材料和方法

实验结果

小结一

二、对乙酰氨基酚(APAP)的急性毒性研究

材料和方法

实验结果

小结二

讨论

三、阿霉素(DOX)的心脏毒性研究

材料和方法

实验结果

小结三

讨论

讨论

参考文献

第二部分：豚鼠镍过敏性接触性皮炎模型的建立

摘要

引言

1．镍及镍过敏性接触性皮炎

2．国内外研究现状及发展动态分析

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

实验结果

1．一般体征观察

2．激发部位皮肤反应

3．激发后72h皮肤病理变化

4．胸腺指数与脾指数

5．皮损组织IL-2、INF-γ变化

讨论

参考文献

英文缩略词表

致谢

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