H3N2亚型流感病毒Vero细胞冷适应株减毒特性及假病毒评价中和抗体的研究

摘要

疫苗是预防流感的主要有效手段，在我国使用的流感疫苗仅有灭活的裂解疫苗或亚单位疫苗。流感减毒活疫苗滴鼻接种，使用方便，既可激发体液免疫，又可诱导产生局部黏膜免疫和细胞免疫，免疫保护效果优于灭活疫苗。但目前只有美国和俄罗斯生产流感减毒活疫苗，他们所使用的冷适应株骨架病毒分别为A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、B/Ann Arbor/1/66和A/Leningrad/134/17/57(H2N2)、B/USSR/60/69。2003年第一支流感减毒活疫苗Flumist(R)在美国生产上市，上市之初疫苗适用人群年龄为5-49岁，2008年批准用于2岁及以上儿童。但都是用鸡胚作为培养基质生产的，以鸡胚作为基质生产流感减毒活疫苗，存在外源因子污染和将鸡传染病原因疫苗接种播散到人的潜在风险。此外，鸡蛋供应周期长，当大流感来袭时难以满足大规模生产，尤其是禽流感病毒来袭时鸡胚来源更受影响。鉴于此，WHO建议以哺乳动物细胞代替鸡胚作为流感疫苗生产基质，非洲绿猴肾细胞Vero细胞是WHO批准生产人用疫苗的传代细胞系。流感病毒在Vero细胞培养敏感性差，大多数毒株都不能增殖或者不能稳定传代。目前以Vero细胞作为培养基质生产的流感病毒疫苗只有3种，都是由美国Baxter公司研发生产(BSL-3)。一种是针对H5N1流感大流行前的疫苗Vepacel(R)，在欧盟成员国销售;另一种是抗A(H1N1)pdm09的灭活流感疫苗Celyapan(R)，已在欧洲批准上市;第三种是三价季节性流感裂解灭活疫苗Preflucel(R)，其Ⅲ期临床试验已在18-49岁健康人群中完成。现尚无以Vero细胞为基质生产的流感减毒活疫苗，选育流感病毒Vero细胞冷适应株对于流感减毒活疫苗的研发至关重要，目前世界各国选育出的流感病毒Vero细胞冷适应株极为稀少，仅见一株A/Singapore/1(-)/57ca(H2N2)报道。 我们实验室在流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)的基础上，经梯度降温选育出Vero细胞冷适应株，已在25℃连续传代50代。本实验中，对选出的A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)P50毒株在Vero细胞上25℃连续传代22代，TCID50/mL保持10-7-10-7.5，25℃，33℃和39℃的log10 TCID50/mL分别为7.5、7.7和3.7，具有冷适应表型(ca)和温度敏感表型（ts）;用107TCID50的病毒量滴鼻免疫雪貂，免后3天雪貂鼻甲和肺部的log10TCID50/g分别为2.6±0.3和1.4±0.1，表明此Vero细胞冷适应株具有减毒表型（att）;滴鼻免疫小鼠能产生体内细胞和体液免疫保护。经血清学鉴定，与H3N2抗血清血抑滴度达1∶1280，而与H1N1、Bv和By抗血清无交叉，提示无其它亚型流感病毒交叉污染，比对第50代和第72代Vero细胞冷适应株基因序列，PB1片段G68T和NS片段C104G，均为无义突变，而其它片段未发现基因突变。 搞清流感病毒Vero细胞冷适应株的冷适应相关基因，对加快流感病毒Vero细胞冷适应株的选育和流感减毒活疫苗的研发具有重要意义。目前研究报道的冷适应相关基因主要集中在PB2、PB1和PA片段，M、NP和NS片段亦有报道。本实验中，对A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)冷适应前后病毒株的基因和氨基酸序列进行比对，进一步模拟其3D结构并分析，结果提示PB1基因编码的PB1和PB1-F2蛋白冷适应前后变化较大，推测PB1可能是冷适应相关基因之一。进而利用反向遗传学技术，将冷适应株与Vero细胞适应株的PB1片段质粒互换，分别拯救流感病毒Vca/VaPB1和Va/VcaPB1。拯救株在Vero细胞上连续传代4代，Vca/VaPB1在33℃和25℃的log10 TCID50/mL分别为7.1和3.8，表明此拯救株不具有ca表型，而Va/VcaPB1在33℃和25℃的log10 TCID50/mL分别为7.4和6.5，证实PB1基因与流感病毒Vero细胞冷适应相关。 科学家预测本世纪人类有面临流感大流行的风险，A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)作为Vero细胞大流行流感减毒活疫苗的母本株，可与高致病性禽流感病毒重配制备Vero细胞大流行流感减毒活疫苗毒种。但在评价疫苗免疫保护效果时，若直接使用病毒作为抗原，存在生物安全风险，需在BSL-3级实验室完成。流感假病毒，只能复制一代、不具感染性，如能采用流感假病毒来检测则可降低生物安全级别。本试验中，构建H5N1和H1N1亚型流感假病毒，以之作为病毒抗原，同时采用血抑试验、中和试验和ELISA检测抗原的微量中和试验，检测NIBSC标准血清、McAb、羊抗血清以及人群样本血清中相应亚型流感病毒的抗体滴度，并与完整病毒相比较。结果表明，假病毒与完整病毒检测的抗体滴度差异无统计学意义，同时采自2013年的人群血清抗体检测结果提示，人群中H5N1抗体阳性率为2.1％，抗体滴度17.82(8.72，36.43)，而H1N1抗体阳性率达53.5％，抗体滴度25.78(22.09，30.08)。假病毒可用于流感中和抗体的评价。

目录

摘要

第一部分 H3N2亚型流感病毒Vero细胞冷适应株的连续传代和减毒特性研究

前言

第一节 H3N2亚型流感病毒Vero细胞冷适应株的连续传代

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第二节 A／Yunnan／1／2005Vca(H3N2)ca、ts和att表型的鉴定

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第三节 A／Yunnan／1／2005Vca(H3N2)对小鼠免疫保护性的研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 A／Yunnan／1／2005Vca(H3N2)冷适应相关基因的研究

前言

第一节 冷适应前后毒株氨基酸序列分析

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第二节 反向遗传学验证冷适应相关基因PB1

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 流感假病毒评价中和抗体的研究

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述 流感疫苗的发展现状

附录

致谢

个人简历

声明