三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及表达模式分析

摘要

三萜皂苷存在于多种药用植物中，其分布广泛、种类复杂，具有多种药理作用。但天然药用植物资源有限，三萜皂苷的含量也往往较低，这些因素严重限制了其活性的开发和利用。近年来，应用分子生物学和基因工程方法加快了药用植物次生代谢途径的研究。在三萜皂苷生物合成途径中鉴定关键酶的功能，已成为研究的热点。本研究从三七（Panax notoginseng）、西洋参（Panax quinquefolium）中克隆了七个三萜皂苷合成关键酶基因，为实现三萜皂苷体外异源表达奠定基础。
　　 本研究通过检索四年生三七、西洋参根转录组数据库，应用生物信息学方法拼接、注释，筛选参与三萜皂苷合成基因的转录本序列。最终获得参与次生代谢产物三萜皂苷合成途径中关键酶的编码基因包括:三七法呢基焦磷酸合酶基因(PnFPS)、鲨烯合酶基因(PnSS)、鲨烯环氧酶基因(PnSE)、达玛烯二醇合酶基因（PnDS）;西洋参细胞色素P450单加氧酶基因(PqCYP450)和糖基转移酶基因(PqUGT)。利用RT-PCR、3'-RACE及5'-RACE技术进行基因cDNA全长的克隆，其中PnFPS、PnSS、PnSE1、PnSE2、PnDS基因cDNA序列已提交到NCBI的数据库(GenBank，登录号依次为KC953034、KC953032、KC953033、JX625132和KC953035)。运用生物信息学方法对上述三七和西洋参中七个基因预测编码蛋白的理化性质、二级结构、保守域、系统进化树及蛋白跨膜区等进行预测，结果表明这些关键酶均具典型保守结构域，与同科植物人参、西洋参中相关酶具较高同源性。
　　 采用Real-time PCR方法检测PnFPS、PnSS、PnSE1、PnSE2、PnDS基因在三七根、茎、叶、花中的表达模式。结果表明，这些基因在花中表达量最高;除PnSE2之外，其余四个基因均在根中表达最低。同时，检测四年生三七叶片受MeJA诱导后0，3，6，24小时，这些基因的表达量。结果表明，MeJA诱导后6小时，三七叶片中PnFPS和PnDS基因表达量与对照相比明显增高;诱导24小时后，PnDS的表达量达到最大（上调近60倍）;PnSS基因表达量在诱导6-24小时后上调3倍;PnSE1基因响应MeJA诱导，随诱导时间的增加，在24小时处表达水平上调15倍;而在相同诱导条件下，PnSE2基因的表达水平则无明显变化。
　　 本研究首次系统的对三七三萜皂苷合成途径中五个关键酶编码基因的表达模式进行分析，与其他三组织比较，它们均在花中表达量丰富;且受MeJA诱导，表达量均有不同程度的增加（除PnSE2外）。三七中PnSE1和PnSE2具不同表达模式，推测PnSE1参与三萜代谢合成途径，而PnSE2参与甾醇代谢合成途径。本研究为阐明三萜皂苷合成途径及相关关键酶的功能奠定基础，对后续关键酶的功能鉴定及构建异源表达体系对三萜皂苷进行体外合成具重要意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述

第一节 三萜皂苷的结构类型

1 四环三萜的类型

2 五环三萜的类型

3 人参皂苷的分类

第二节 三萜皂苷的药理活性研究

1 抗肿瘤活性

2 免疫调节作用

3 对心脑血管系统的调节作用

4 神经调节及保护作用

5 保肝作用

6 人参皂苷的结构和药理作用

第三节 三萜皂苷的合成途径

1 IPP和DMAPP的合成

2 2，3-氧化鲨烯的生物合成与修饰

3 达玛烷合酶DS催化2，3-氧化鲨烯生成达玛烷二醇

第四节 三萜皂苷合成途径中关键酶研究

1 法呢基焦磷酸合酶

2 鲨烯合酶

3 鲨烯环氧酶

4 达玛烷合酶

5 糖基转移酶

6 细胞色素P450单加氧酶

第五节 三七、西洋参相关研究进展

1 三七相关研究进展

2 西洋参相关研究进展

第三节 本研究的目的和意义

第二章 三七、西洋参中三萜皂苷合成关键酶基因的克隆及序列分析

第一节 材料、试剂及仪器

1 实验材料

2 实验试剂

3 实验仪器

第二节 实验方法

1 Total RNA的提取

2 cDNA合成

3 基因挖掘及扩增

4 PCR产物回收、连接、转化及测序

5 三萜皂苷合成途径中关键酶基因生物信息学分析

第三节 实验结果

1 三七、西洋参根、茎、叶、花Total RNA提取结果

2 三萜皂苷合成途径中关键酶编码基因cDNA的克隆

3 三萜皂苷合成途径关键酶编码基因的生物信息学分析

第四节 讨论

第五节 小结

第三章 三七中三萜皂苷合成途径中关键酶基因的表达分析

第一节 材料、试剂及仪器

1 植物材料准备和处理

2 实验试剂

3 实验仪器

第二节 实验方法

第三节 实验结果与讨论

1 三七叶片Total RNA检测结果

2 内参基因溶解曲线分析

3 三七不同组织中三萜皂苷合成关键酶基因表达量分析

4 三七关键酶基因受MeJA诱导表达分析

第四节 讨论

第五节 小结

附表

致谢

硕士期间科研成果

参考文献