Akt1基因修饰的骨髓MSCs治疗ConA诱导的小鼠急性肝损伤的实验研究

摘要

研究目的: 1.原代培养出小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并鉴定; 2.构建PMSCV-Akt1-IRES-GFP逆转录病毒载体，感染MSCs，并筛选、扩增Akt过表达的MSCs; 3.体外研究过表达Akt1对小鼠MSCs生物学功能的影响; 4.观察Akt1-MSCs对不同浓度刀豆蛋白A(ConA)诱导的肝损伤模型的疗效。 研究方法: 取C57小鼠胫骨和股骨，利用MSCs的贴壁生长能力进行分离，并对获取的细胞进行流式鉴定和成软骨和成脂培养;构建Akt1-IRES-GFP逆转录病毒载体，感染MSCs，并筛选、扩增Akt1过表达的MSCs，并同时构建GFP-MSCs作为对照;使用RT-PCR及western blot的方法检测Akt1-MSCs的Akt1的基因、蛋白及磷酸化蛋白的表达水平;分别用浓度为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ处理Akt1-MSCs及GFP-MSCs细胞，采用四唑氮化合物(MTS)法测定MSCs的生长情况并绘制生长曲线，通过Ca2+依赖性磷脂结合蛋白/碘化丙啶(AnnexinⅤ/PI)复染，观察不同浓度IFN-γ对Akt1-MSCs及MSCs细胞凋亡的影响，并使用pcr-array对Akt1-MSCs及GFP-MSCs的凋亡信号通路进行检测，比较两者的异同;使用RT-PCR的方法检测10ng/mlIFN-γ刺激前后Akt1-MSCs及GFP-MSCs中Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的表达情况;使用ELISA的方法检测经浓度分别为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ刺激Akt1-MSCs及GFP-MSCs后，培养基中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量;使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治疗致死剂量ConA(40mg/kg)所致小鼠急性肝损伤，观察小鼠的生存情况并绘制生存曲线并了解小鼠肝脾的病理变化;使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治疗ConA(20mg/kg)所致的急性肝损伤模型，观察AST、ALT、TNF-α及IFN-γ的及肝脾病理变化，同时使用ELISA方法检测小鼠血清中IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE2的含量并通过活体成像观察Akt1-MSCs及GFP-MSCs在ConA所致的急性肝损伤模型中向肝脏的归巢情况。 研究结果: 成功培养出小鼠MSCs: MSCs高表达CD29、CD44、Sca-1，而不表达造血细胞标志CD45、CD34，也不表达CD11b、CD31、FLK-1、MtHC-Ⅱ类分子，成功将MSCs诱导分化成为软骨细胞和脂肪细胞;成功筛选并扩增出Akt1-MSCs，RT-PCR显示Akt1-MSCs的Akt1基因表达量明显高于GFP-MSCs(P＜0.01)，Western blot显示Akt1-MSCs的总Akt1蛋白及磷酸化Akt(Ser473)蛋白均高于GFP-MSCs;细胞增殖及凋亡实验显示在正常培养及高浓度IFN-γ(100ng/ml)的刺激下，Akt1-MSCs显示出了增殖及抗凋亡优势，PCR-array显示Akt1-MSCs可显著抑制外源性凋亡通路;RT-PCR显示，Akt1-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、VEGF、HGF及PGE-2的基因表达水平均高于GFP-MSCs，在采用10ng/ml IFN-γ刺激后，Akt1-MSCs及GFP-MSCs的Akt1、IL-4、IL-10、HGF及PGE2的基因表达水平均有所上调，但Akt1-MSCs上调幅度更明显，且VEGF的基因表达水平未见明显上调;分别采用不同浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml) IFN-γ刺激Akt1-MSCs及GFP-MSCs后，ELISA结果显示:在10ng/ml、50ng/ml IFN-γ刺激12h后，Akt1-MSCs培养基中IL-10浓度明显高于GFP-MSCs，在100ng/ml IFN-γ刺激12h后，Akt1-MSCs及GFP-MSCs的细胞因子IL-10表达水平无明显差异。在10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml IFN-γ刺激后，细胞因子PGE-2的含量两者无明显差异，而Akt1-MSCs培养基中HGF和VEGF的浓度显著高于GFP-MSCs。由于培养基IL-4浓度过低（各组均＜4pg/ml），未得出可分性的数据;使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治疗致死剂量ConA(40mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤，小鼠共分为5组，每组10只。24小时后，ConA40mg/kg、 ConA40mg/kg+1×106 Akt1-MSCs、ConA40mg/kg+1×106 MSCs的三组小鼠均全部死亡，ConA40mg/kg+5×106 Akt1-MSCs组存活3只、ConA40mg/kg+5×106 MSCs组存活1只。使用Akt1-MSCs及GFP-MSCs治疗ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤模型，结果显示:与GFP-MSCs相比，Akt1-MSCs可以更好地降低小鼠血清中AST、ALT、TNF-α及IFN-γ水平和改善小鼠肝脏病理损伤情况，其中AST及IFN-γ的降低尤为显著。Akt1-MSCs治疗组小鼠血清中IL-10、VEGF、HGF及的浓度均高于GFP-MSCs治疗组小鼠，而由于小鼠血清中IL-4浓度过低（各组均＜4pg/ml，故未得出可分性的数据）。活体成像结果显示，第0天，ConA+Akt1-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)强于ConA+GFP-MSCs组，单纯Akt1-MSCs及GFP-MSCs组未检测出明显荧光。第7天，ConA+Akt1-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)局部有所升高，而ConA+GFP-MSCs、Akt1-MSCs及GFP-MSCs组未检测出明显荧光。第14天，Akt1-MSCs组小鼠肝脏GFP荧光强度(465nm)强于MSCs组，而ConA+Akt1-MSCs和ConA+GFP-MSCs组未检测到明显荧光。 研究结论: 通过本研究，我们1）原代培养出小鼠MSCs，流式细胞免疫表型鉴定符合MSCs表型表达特点，并将MSCs诱导分化成为软骨细胞和脂肪细胞;2）构建PMSCV-Akt1-IRES-GFP逆转录病毒载体，感染MSCs，并筛选、扩增出出Akt1过表达的MSCs;3) Akt1-MSCs比相同代数的MSCs在正常培养及高浓度IFN-γ(100ng/ml)的刺激下增殖及抗凋亡能力均明显优于GFP-MSCs;4）在10ng/ml IFN-γ刺激前后，Akt1-MSCs的部分细胞因子的基因表达水平高于GFP-MSCs，且Akt1-MSCs表现出对IFN-γ刺激更强的应激能力;5）在不同浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml) IFN-γ刺激12h后，Akt1-MSCs的旁分泌功能优于GFP-MSCs;6）5×106 Akt1-MSCs可提高致死剂量ConA(40mg/kg)所致的急性肝损伤小鼠的存活率;7）Akt1-MSCs可显著改善ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤状况;8）在ConA(20mg/kg)所致的小鼠急性肝损伤模型和正常小鼠中，Akt1-MSCs体现出了向肝脏归巢的优势。

目录

摘要

前言

材料与方法

实验材料

实验方法

实验结果

1 小鼠骨髓MSCs培养与扩增

2 小鼠骨髓间充质干细胞鉴定

3 小鼠骨髓MSCs成软骨和成脂分化

4 构建PMSCV-Akt1-IRES-GFP

5 包装PMSCV-Akt1-IRES-GFP及PMSCV-IRES-GFP逆转录病毒病毒，并感染小鼠MSCs

6 Akt1-MSCs Akt1基因及蛋白表达水平均高于及GFP-MSCs

7 细胞增殖及凋亡实验显示在正常培养及高浓度IFN-γ(100ng／ml)的刺激下，Akt1-MSCs显示出了增殖及抗凋亡优势

8 PCR-Array结果

9 RT-PCR检测Akt1-MSCs及GFP-MSCs部分基因表达情况

10 ELISA检测不同浓度IFN-γ刺激后，培养上清中部分细胞因子的含量

11 构建致死剂量ConA(40mg／kg)所致肝损伤模型

11 hkt1-MSCs及GFP-MSCs对ConA(40mg／kg)所致小鼠肝损伤的疗效

12 Akt1-MSCs及GFP-MSCs对ConA(20mg／kg)所致小鼠肝损伤的疗效

讨论

参考文献

综述 骨髓来源的干细胞在肝脏修复中的作用

攻读学位期间发表的文章题录

缩略词表

致谢

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