Ts65Dn小鼠造血干细胞对辐射诱导DNA损伤修复障碍研究

摘要

唐氏综合症(Down Syndrome, DS)是人类常见的染色体疾病，患者有三条21号染色体，伴有肌肉、骨骼和神经发育异常，幼年患儿往往表现为造血系统异常，罹患急性巨核细胞白血病的几率增高。Ts65Dn小鼠与人类21号染色体有104个同源基因，与人类患者有相似的病理特症，例如学习和行为障碍，心脏病等，是目前常用的唐氏综合症模型。 研究表明非整倍体可能降低DNA损伤修复功能，引起基因组的不稳定性。唐氏综合症相关的造血系统异常和恶性肿瘤可能与造血干细胞(HSCs)自我更新能力受损，造血系统基因不稳定有关，为此我们利用唐氏综合症模型小鼠对Ts65Dn小鼠造血干细胞数量、功能及辐射诱导DNA损伤修复机制进行研究。研究发现与野生型对照小鼠(Wild type, WT)相比，Ts65Dn小鼠的骨髓造血干细胞HSCs数量明显减少，造血祖细胞(HPCs)水平没有明显变化;体外单细胞克隆实验结果显示Ts65Dn小鼠HSCs单细胞克隆形成率明显低于对照小鼠，表明Ts65Dn小鼠骨髓HSC数量减少、功能下降。利用γH2AX表达检测Ts65Dn小鼠HSC/HPC损伤DNA双链断裂(DSB)，发现Ts65Dn小鼠γH2AX表达水平高于对照小鼠;体外2Gyγ射线照射后1小时，两种小鼠的HSCs的DSB水平没有差异，但是随着时间延长，照射后3小时和6小时后Ts65Dn小鼠的HSCs的未修复的DSB水平显著高于对照组小鼠。且照射后Ts65Dn小鼠HSCs的克隆形成能力显著降低。与对照小鼠相比，Ts65Dn小鼠造血祖细胞体外克隆能力和DSB水平以及照射后DSB修复能力没有显著差异。结果提示Ts65Dn小鼠在HSC水平出现了DNA损伤修复障碍及功能损伤。 USP16基因编码一种去泛素化酶，Ts65Dn小鼠因多余的基因拷贝表达过高的USP16基因，可能是造血干细胞DSB修复缺陷的重要分子机制。应用RT-PCR两个不同探针检测发现，与WT相比，Ts65Dn小鼠HPC内USP16表达分别升高1.45倍和1.53倍。而HSC内USP16表达分别升高2.21倍和2.04倍。由于Ts65Dn小鼠HSC中USP16过高表达会引起H2A和H2AX的过度去泛素化，干扰双链断裂位置修复蛋白乳腺癌1号基因(BRCA1)复合体，p53结合蛋白(53BP1)等分子的招募，这可能与Ts65Dn小鼠HSC出现DSB修复障碍有关。 综上，我们应用Ts65Dn小鼠作为唐氏综合症动物研究模型，发现Ts65Dn小鼠的造血干细胞出现数量和功能的异常，辐射敏感性增加;Ts65Dn小鼠HSC出现DSB修复障碍，可能与USP16在Ts65Dn小鼠HSC中高表达有关。DSB的正常修复是维持基因稳定性的重要因素。本项研究结果表明Ts65Dn小鼠造血干细胞DSB修复障碍可能是唐氏综合症病人早年造血系统异常以及白血病高发的原因之一。USP16有可能成为唐氏综合症治疗中的潜在靶点。

目录

缩略语表

技术路线

摘要

1 前言

1．1 唐氏综合症表型

1．2 唐氏综合症小鼠模型

1．3 唐氏综合症发病机制研究

1．3．1 发展不平衡学说和基因剂量效应假说

1．3．2 氧化应激

1．3．3 DNA损伤及修复障碍

1．3．4 泛素化调节异常

1．4 唐氏综合症来源造血干细胞功能存在障碍

1．5 唐氏综合症来源造血干细胞功能障碍与DNA损伤及修复

1．5．1 DNA损伤

1．5．2 DNA损伤修复方式

1．5．3 DSB修复相关蛋白

1．5．4 DNA损伤修复障碍相关疾病

1．5．5 造血干细胞DSB损伤修复障碍研究

1．6 唐氏综合症来源造血干细胞组蛋白泛素化异常与DNA修复障碍

1．6．1 泛素与泛素化

1．6．2 DNA双链断裂(DSB)损伤修复与泛素化调节

1．6．3 去泛素化引发DSB损伤修复障碍和衰老

2 实验材料

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．2．1 常用试剂

2．2．2 抗体

2．2．3 主要试剂盒

2．2．4 其他主要试剂及耗材

2．3 引物

2．3．1 小鼠TaqMan泛素特异肽酶16(ubiquitin-specific peptidase 16，USP16)

2．3．2 小鼠TaqMan HPRT

2．4 重要试剂的配制

2．4．1 HSC单细胞培养体系

2．4．2 HPC单细胞培养体系

2．4．3 骨髓细胞短时体外培养体系

2．4．4 红细胞裂解液

2．5 仪器设备

3 实验方法

3．1 HSC／HPC分离

3．1．1 收集骨髓细胞

3．1．2 红细胞裂解

3．1．3 Lin-细胞富集

3．1．4 干细胞标记分型染色

3．1．5 表型分析

3．1．6 细胞分选

3．2 细胞照射及照射后培养

3．3 HSC／HPC功能检测

3．4 细胞甩片和固定

3．5 流式细胞技术分析DSB

3．6 细胞免疫荧光分析DSB

3．7 提取HPC／HSC细胞总RNA

3．7．1 HPC RNA提取

3．7．2 HSC RNA提取

3．8 cDNA制备

3．8．1 HPC cDNA逆转录

3．8．2 HSC cDNA逆转录

3．8．3 HSC cDNA预扩增

3．9 Realtime PCR基因表达检测

4 结果和讨论

4．1．Ts65Dn来源的造血干细胞数量降低，体外克隆形成能力下降

4．2 Ts65Dn小鼠来源造血干细胞双链断裂(DSB)水平升高

4．3 Ts65Dn小鼠来源造血干细胞辐射后DSB修复存在缺陷

4．4 Ts65Dn小鼠来源造血干细胞对辐射引起的增殖抑制作用更为敏感

4．5 USP16高表达可能是Ts65Dn小鼠来源造血干细胞DSB修复缺陷原因之一

5 小结

参考文献

综述一 唐氏综合症患者造血干细胞功能障碍及机制研究进展

前言

1 唐氏综合症表型

2 造血干细胞

3 唐氏综合症小鼠模型

4 唐氏综合症来源造血干细胞存在功能障碍

5．唐氏综合症来源造血干细胞功能障碍机制研究

5．1 发展不平衡学说与基因剂量效应学说

5．2 氧化应激

5．3 DNA损伤修复障碍

5．4 泛素化调节异常

小结

参考文献

综述二 前列腺素E2对造血干细胞的调控作用研究进展

前言

1 PGE2的合成及受体

2 PGE2对HSC的调节作用

2．1 PGE2促进移植归巢率

2．2 PGE2提高HSC移植后的生存率

2．3 PGE2提高HSC的增殖、自我更新及重建能力

3 PGE2调节造血系统稳态

4 小结

参考文献

致谢

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