黏膜型肥大细胞与结肠炎相关结肠癌发展关系的研究

摘要

炎症是肿瘤的重要组成部分，大约四分之一的肿瘤起源于慢性炎症[Grivennikov et al.，2010]，例如炎性肠病（溃疡性结肠炎和克罗恩病）相关结肠癌[Mantovani et al.，2008]。慢性炎症微环境中浸润的大量炎性细胞在肿瘤恶性转化过程中起着重要作用，其中包含大量固有免疫细胞，如巨噬细胞、肥大细胞等。参与一线防御反应的肥大细胞的促瘤作用已在人类和小鼠结肠癌中得到证实，然而人和小鼠肥大细胞至少存在两个亚群，目前的研究主要关注结缔组织型肥大细胞(CTMC)，而较少关注黏膜型肥大细胞(MMC)。本研究通过药物阻断黏膜型肥大细胞活化，探索黏膜型肥大细胞在结肠炎向结肠癌恶性转化过程的作用，并探讨潜在的机制。
　　本课题使用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠结肠癌模型，留取AD1、AD2、AD3期升、降结肠组织及同龄小鼠全结肠组织。前期mRNA表达的组织芯片分析发现，结肠炎向结肠癌发展过程中，肥大细胞相关蛋白酶(MCPs)转录丰度逐渐增加，AD3期达最高，其中MMC特异性蛋白酶(mMCP-1，mMCP-2)增加幅度最大;qRT-PCR检测证实了组织芯片结果;甲苯胺蓝染色检测不同时期肥大细胞的变化，mMCP-1免疫组化染色分析MMC数目的变化。以上数据提示结肠炎向结肠癌发展过程中，结肠组织MMC数量逐渐增多。随后我们使用药物阻断肥大细胞，选取主要作用于MMC的色甘酸二钠(DSCG)及特异性针对CTMC的酮替芬(Ketotifen)，在DSS间歇期灌胃给药2周，至AD3期，并评估结肠肿瘤发展情况。炎症发生前给予DSCG阻断肥大细胞活化，在5个不同时间点处置小鼠，收集标本待检测，并在第14周评估MMC阻断情况:甲苯胺蓝染色检测结肠组织肥大细胞数目、免疫组织化学检测结肠组织MMC数目、ELISA检测血清mMCP-1水平、qRT-PCR检测结肠组织mMCPs转录水平;随后评估结肠肿瘤发展情况。同时探讨了MMC发挥作用的潜在机制，分析不同时间点血清mMCP-1的水平及结肠上皮内细胞中CD11b+Gr-1+MDSCs数量的变化。
　　结肠上皮不典型增生期是结肠炎向结肠癌恶性转化的关键时期，基于以上研究，我们于不典型增生期阻断肥大细胞活化进行治疗，即在第10周给予AOM/DSS小鼠1周DSCG或3天Doxantrazole（非选择性肥大细胞膜稳定剂），并设置相应溶剂对照组。评估肥大细胞阻断情况:甲苯氨蓝染色检测肥大细胞数目，ELISA检测血清及结肠组织间液mMCP-1水平，随后评估结肠肿瘤情况。以上实验结果提示，mMCP-1可能与CD11b+Gr-1+MDSCs的募集有重要关联。健康小鼠腹腔注射不同浓度mMCP-1及生理盐水，24 hr后行腹腔盥洗收获细胞，流式染色分析CD11b+Gr-1+细胞比例的变化。
　　实验结果:从AD1到AD3期，结肠组织MMC数目逐渐增加，AD3期最多。AOM注射两天之后，损伤结肠组织肥大细胞迅速募集。炎症发生前给DSCG可显著阻断黏膜型肥大细胞:黏膜型肥大细胞数目减少;血清mMCP-1水平显著下降;mMCP-1和mMCP-2转录水平显著下调，而结缔组织型肥大细胞相关基因(Cpa3，mMCP-4，mMCP-6)转录水平则无显著差异;同时结肠肿瘤数目、大小及负荷均显著减少，且结肠的缩短程度较Sham组有明显改善。结肠上皮不典型增生期药物阻断MMC情况:治疗组肥大细胞数目明显较其溶剂对照组减少;治疗组血清及结肠组织间液mMCP-1水平均明显下降;治疗组肿瘤数目、结肠重量显著减少。15ng/ml mMCP-1可显著增加腹腔CD11b+Gr-1+细胞的募集。第14周DSCG组小鼠结肠组织、脾脏及肠系膜淋巴结中CD11b+Gr-1+ MDSCs的聚集较Sham组显著;结肠炎向结肠癌发展不同阶段CD11b+Gr-1+细胞的变化趋势与mMCP-1的水平一致，均较Sham组降低，且在第14周显著降低。
　　以上结果表明，结肠炎向结肠癌发展过程中，黏膜型肥大细胞可能通过活化释放mMCP-1募集CD11b+Gr-1+MDSCs到结肠损伤部位，促进恶性转化。

目录

图表索引

中英文缩略词

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

一、小鼠结肠肿瘤组织中黏膜型肥大细胞增多

二、DSCG治疗性实验结果

三、预防性给予DSCG可显著阻断黏膜型肥大细胞

四、预防性阻断黏膜型肥大细胞可明显延缓结肠炎相关结肠癌发展

五、不典型增生期阻断黏膜型肥大细胞可显著抑制恶性转化

六、黏膜型肥大细胞可能通过mMCP-1募集CD11b+Gr-1+MDSCs促进结肠炎相关结肠癌发展

讨论

结论

参考文献

基金资助

己发表与学位论文相关的英文论文

文献综述 肥大细胞与肿瘤研究新进展

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