DNase Ⅰ与2型糖尿病胰腺损伤关系探讨:从Bcl--2/Caspase--3通路探讨高血糖环境中DNase Ⅰ增高与胰腺损伤的关系

摘要

DNaseⅠ是由260个氨基酸组成的单体糖蛋白，在Ca2+存在的条件DNaseⅠ可以水解双链DNA，生成具有5'磷酸和3'羟基末端的寡核苷酸。有研究发现DNaseⅠ与细胞凋亡、个体发育及自身防御等有着密切的联系。随着研究的深入发现DNaseⅠ不仅是一种可以降解外源DNA的水解酶，同时该酶还在细胞凋亡、降解坏死细胞的染色质方面起到很大作用。在细胞凋亡过程中，死亡细胞的DNA片段会被内源性的DNaseⅠ降解形成180-200bp的DNA片段，最终完全被降解成核苷酸从而参与新的DNA的复制。除了广泛参与细胞凋亡的过程外，目前DNaseⅠ已经被发现与系统性红斑狼疮和急性心肌梗死关系密切。然而作为一种主要由胰腺所分泌的酶，DNaseⅠ与2型糖尿病之间的关系，却少有报道。在课题组前期研究过程中，我们发现DNaseⅠ在2型糖尿病患者血清中出现了明显的升高。而据报道血清中60％-65％的DNaseⅠ活性都是由胰腺所分泌的，因此我们推测血清中DNaseⅠ的升高可能与胰腺存在着密切的关系。再者由于DNaseⅠ的升高可以促进细胞的凋亡，基于此我们推测DNaseⅠ的升高可能参与了糖尿病患者胰腺的损伤。因此本研究通过体内实验与体外实验相结合，来检测DNaseⅠ在胰腺损伤过程中的重要作用。 目的: 观察DNaseⅠ表达升高与2型糖尿病高糖所引起的胰腺损伤之间的关系，为进一步深入了解糖尿病发病机制及其并发症的发展提供新的思路，同时为胰腺损伤的分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。 方法: 1、DNaseⅠ在2型糖尿病患者血清及胰腺组织中的观察。 1.1、本部分实验通过收集在我院就诊的2型糖尿病患者以及健康志愿者血清，采用辐射状酶扩散法对血清中DNaseⅠ的活性进行对比分析，来探讨DNaseⅠ在血清中的改变情况。 1.2、收集本院近两年患有2型糖尿病及未患有2型糖尿病的胰腺癌患者手术切除的癌旁组织进行免疫组织化学分析，观察DNaseⅠ在胰腺组织中的定位，同时对阳性表达区域进行半定量分析。 2、体内实验研究胰腺组织中DNaseⅠ的蛋白及mRNA表达变化。观察高脂饲料合并STZ诱导的2型糖尿病大鼠胰腺组织中DNaseⅠ的表达变化来探讨DNaseⅠ在高糖引起的胰腺损伤中的作用，通过免疫组织化学，Western Blot及Real-time PCR对DNaseⅠ的作用进行更加深入探讨。 3、采用高糖刺激胰岛β细胞模型，验证高糖环境下DNaseⅠ表达与细胞凋亡之间的关系。通过采用高糖培养基（30mmol/L），验证糖毒性对胰岛β细胞的损伤。通过外源性给予DNaseⅠ及siRNA敲降，观察高糖环境中DNaseⅠ与胰岛β细胞损伤之间的关系。 4、DNaseⅠ与糖尿病肾病损伤之间的关系探讨。本部分实验主要通过观察高脂饲料合并STZ诱导的2型糖尿病大鼠肾脏中DNaseⅠ的变化，观察DNaseⅠ与糖尿病肾病之间的关系。 结果: 一、临床样本结果 (1)和健康对照组相比，2型糖尿病患者血清中DNaseⅠ的活性出现了明显的升高(p＜0.01)，且该增高的趋势在不同性别之间无显著性差异。 (2)免疫组织化学结果显示，在胰腺癌不伴随糖尿病的患者胰腺组织中DNaseⅠ主要表达在胰岛细胞中，而在在胰腺癌伴随糖尿病患者的胰腺组织中，我们发现DNaseⅠ在胰岛中的表达有升高的趋势(p＜0.05)，同时腺泡中也出现了大量的DNaseⅠ阳性表达(p＜0.001)。 二、体内实验结果 (1)和正常组大鼠相比，我们发现高脂合并STZ诱导的大鼠血清中DNaseⅠ的活性在第2周和第20都出现了明显的升高(p＜0.05)。 (2)免疫组织化学结果显示DNaseⅠ在2型糖尿病大鼠胰腺中的改变与人类胰腺组织中变化趋势较一致，和正常大鼠相比，在第2周和第20周胰岛中的DNaseⅠ均出现了明显的升高(p＜0.05)，同时伴随着DNaseⅠ在腺泡中出现显著性的升高(p＜0.001)。 (3)和正常组相比，Western Blot结果显示，糖尿病大鼠的胰腺组织中DNaseⅠ的表达在第2周和第20周中均出现了显著性的升高(p＜0.05)。但是Caspase-3则仅出现了升高的趋势而无统计学意义。Bcl-2在第2周出现显著性下降(p＜0.05)，而在第20周两组之间则无显著性差异(p＞0.05)。Realtime-PCR结果显示两组之间在第2周和第20周mRNA表达均未出现明显的改变。 三、体外实验结果 (1)激光共聚焦结果显示DNaseⅠ广泛存在于细胞质和细胞核中。 (2)和正常对照组（11.1mmol/L）相比，高糖刺激(30mmol/L)可以明显引起ⅠNS-1细胞DNaseⅠ，Caspase-3的表达升高(p＜0.05)。DNaseⅠ敲降后则可以显著降低高糖刺激的细胞内Caspase-3的表达(p＜0.05)，而敲降并未对Bcl-2的蛋白表达水平造成明显改变。 (3)流式细胞仪结果显示，正常培养条件下INS-1细胞的凋亡率仅为7.9％，而高糖刺激则可以明显引起细胞的凋亡，凋亡率为18.1％，敲降细胞内DNaseⅠ的表达后则可以明显减少高糖刺激后的细胞的凋亡（凋亡率为9.9％）。 (4)外源性的给予胰岛β细胞5mU/ul和50 mU/ul的DNaseⅠ后，采用流式细胞仪进行观察，发现正常组的凋亡率为7.2％，而5mU/ul DNaseⅠ组的凋亡率为6.9％，50mU/ul DNaseⅠ组的凋亡率为9.8％;予高糖刺激后在再进行相应浓度的DNaseⅠ刺激，我们发现高糖组的凋亡率为17.3％，高糖+5mU/ul DNaseⅠ组的凋亡率为21.8％，高糖+50mU/ul DNaseⅠ组的凋亡率为34.6％。并且我们也通过TUNEL实验对该部分的实验结果进行了验证，并且得到了较为一致的结果。 四、大鼠肾脏DNaseⅠ表达 和正常组相比，20周时模型组大鼠肾脏基底膜及足突出现明显的损伤;PAS结果显示肾小球中出现了明显的糖原沉积。Western Blot结果显示在第2周和第20周时大鼠肾脏中DNaseⅠ的表达水平出现了明显的升高。Bcl-2和Caspase-3的变化趋势同胰腺组织中的变化趋势。 结论: (1)2型糖尿病患者伴随着血清中DNaseⅠ活性明显升高，同时在高脂合并SZT诱导2型糖尿病大鼠血清中，也发现了血清中DNaseⅠ的活性出现显著性升高，我们推测DNaseⅠ可能参与了糖尿病的发病过程。 (2)高糖刺激可以引起胰岛β细胞内DNaseⅠ的蛋白表达明显的升高，同时伴随着细胞凋亡率的显著增加;而敲降细胞内DNaseⅠ的表达水平后可以明显降低细胞的凋亡率;在体内实验中也发现高血糖可以导致胰腺和肾脏组织中DNaseⅠ的显著性升高，由此我们推测DNaseⅠ可能参与了2型糖尿病胰岛β细胞的凋亡过程，同时DNaseⅠ的升高可能也参与糖尿病肾病的发病过程。 本研究首次发现在2型糖尿病患者血清中DNaseⅠ活性出现明显的升高。同时我们也第一次发现在2型糖尿病患者和大鼠的胰腺腺泡组织中，DNaseⅠ的表达出现了极显著的升高;通过体外实验证实了高糖刺激可以导致胰腺组织内DNaseⅠ的表达明显上调，从而介导了高糖引起的胰腺细胞的凋亡的发生。通过本项研究可以为2型糖尿病胰腺损伤的预防及2型糖尿病的发病机制提供新的思路。

目录

摘要

缩略词表

前言

第一部分 2型糖尿病患者血清DNase Ⅰ活性显著升高

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

小结

第二部分 2型糖尿病胰腺DNase Ⅰ表达与细胞凋亡关系探讨

实验一 2型糖尿病大鼠血清DNase Ⅰ表达

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

实验二 2型糖尿胰腺癌患者和2型糖尿病大鼠胰腺组织DNase Ⅰ表达

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

小结

第三部分 DNase Ⅰ与高糖诱导的INS-1细胞凋亡

实验一 DNase Ⅰ敲降对高糖刺激的INS-1细胞凋亡的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

实验2 外源性DNase Ⅰ含量升高对INS-1细胞凋亡通路的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

小结

第四部分 2型糖尿病大鼠肾脏DNase Ⅰ表达

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

小结

总结

特色与创新

文献综述1 DNase Ⅰ与糖尿病关系初探

文献综述2 NADPH氧化酶在糖尿病肾病氧化应激损伤过程中的作用

参考文献

致谢

个人简历

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