新型EGFR/VEGFR双靶点抑制剂的设计、合成及抗肿瘤活性研究

摘要

目的:近年来，多靶点酪氨酸激酶抑制剂已成为小分子抗肿瘤药物研发的热点。本课题旨在通过计算机辅助药物设计、化学合成等方法得到目标化合物，并对其进行分子水平、细胞水平和整体动物模型的生物学研究，以期得到对EGFR和VEGFR-2均具有抑制活性的双靶点抗肿瘤候选药物。
　　方法:通过对4-苯胺基喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂的构效关系研究，分析喹唑啉母核所能连接的有利基团或者侧链结构，以及阳性化合物凡德他尼与EGFR、VEGFR蛋白晶体的结合模式，采用计算机辅助药物设计的方法，设计了4个系列新型的4-苯胺喹唑啉类化合物，并由本实验室化学合成;采用HTRF法对化合物进行EGFR和VEGFR-2两个靶点的体外活性筛选;采用MTS法对化合物进行人肿瘤细胞（A431、A549、MDA-MB-231）增殖抑制的体外活性评价;采用细胞划痕损伤模型评价化合物对人肿瘤细胞(A431)及脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移能力的影响;利用流式细胞术检测化合物对细胞凋亡的影响;采用A431细胞的裸鼠异种移植瘤模型评价其体内抗肿瘤活性;Western blotting法分析化合物对EGFR、VEGFR-2在肿瘤组织内表达的影响。
　　结果:1）设计、合成得到4个系列共12个新型的4-苯胺喹唑啉类化合物;2）体外激酶筛选得到化合物TYIG4～TYIG12对EGFR和VEGFR-2均具有较好的活性;3)同样，这8个化合物对肿瘤细胞(A431、A549、MDA-MB-231)的生长均有不同程度的抑制作用，其中TYIG10的增殖抑制作用更为突出;4）细胞划痕损伤试验表明TYIG10在1μmol·L-1、3μmol·L-1时对A431及HUVEC细胞均具有较强的迁移抑制能力;5）流式细胞术检测出TYIG10在1μmol·L-1、3μmol·L-1、10μmol·L-1时均可以诱导A431细胞凋亡，凋亡率依次为18.7％、29.1％、35.4％;6）体内试验结果表明TYIG10能够剂量依赖的抑制肿瘤生长，TYIG10在25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg剂量时对A431细胞的相对肿瘤生长抑制率分别为44.0％、56.7％、69.6％;7）Western blotting结果表明TYIG10可以抑制A431肿瘤组织内EGFR和VEGFR-2的表达，验证了其抗EGFR、VEGFR-2的双靶点机制。
　　结论:TYIG10具有良好的体内、外抗肿瘤作用，对EGFR和VEGFR-2均表现出很强的抑制活性，具有成为新型双靶点酪氨酸激酶抑制剂的潜能，有进一步的研究价值。

目录

摘要

前言

第一部分 新型4-苯胺基喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂的设计

1．1 4-苯胺基喹唑啉类衍生物的设计背景

1．2 4-苯胺基喹唑啉类抑制剂构效关系研究

1．3 目标化合物的设计思路

1．3．1 凡德他尼与EGFR蛋白晶体结合模拟图

1．3．2 凡德他尼与VEGFR-2蛋白晶体结合模拟图

1．4 目标化合物的设计

1．5 小结

第二部分 目标化合物的化学合成

2．1 目标化合物的逆合成分析

2．2 化合物喹唑啉母核的合成路线通式

2．2．1 A系列化合物侧链的合成

2．2．2 A系列化合物的合成

2．2．3 B系列化合物侧链的合成

2．2．4 B系列化合物的合成

2．2．5 C系列化合物的合成

2．2．6 D系列化合物侧链的合成

2．2．7 D系列化合物的合成

2．3 小结

第三部分 目标化合物的生物活性评价

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 动物与细胞株

3．2 实验方法

3．2．1 体外激酶活性筛选

3．2．2 体外细胞活性筛选

3．2．3 细胞迁移-划痕实验

3．2．4 流式细胞术检测细胞凋亡

3．2．5 化合物体内抗肿瘤活性的研究

3．2．6 Western blotting检测EGFR和VEGFR-2的表达水平

3．3 结果

3．3．1 体外激酶活性筛选结果

3．3．2 肿瘤细胞的增殖抑制活性结果

3．3．3 细胞迁移-划痕实验结果

3．3．4 流式细胞术检测细胞凋亡结果

3．3．5 体内抗肿瘤活性结果

3．3．6 肿瘤组织内EGFR和VEGFR-2的表达水平

3．4 小结

第四部分 讨论及结论

参考文献

综述 EGFR和VEGFR小分子抑制剂的研究进展

附录1 英文缩略词汇表及中文对照

附录2 溶液配制

附录3 在校期间己发表学术论文及会议摘要

致谢

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