以IspD为靶点的新型抗结核药物筛选研究

摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐药问题日趋严重，针对新靶标开发全新机制的抗结核药物是抗击耐药结核分枝杆菌的有效途径。MTB细胞壁结构独特，对于MTB的生长繁殖以及致病性至关重要。因此，MTB的细胞壁生物合成途径蕴含着大量潜在的抗结核新靶标。
　　异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)及其同分异构体二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)是MTB细胞壁中肽聚糖层和阿拉伯半乳糖层的必须前体，2-C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径是MTB生物合成IPP和DMAPP的唯一途径。该途径共有8个蛋白参与催化反应，2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，IspD）是该途径的关键限速酶。本研究旨在获得靶向IspD的新型抗结核药物，并以此为探针验证IspD作为抗结核新靶标的可行性。
　　本论文共完成了三个主要的研究内容:第一是采用MTBH37Rv的全细胞筛选模型对化合物库4万个样品进行初筛和复筛，得到159个在质量浓度为20μg/ml时能抑制MTB生长的阳性化合物，阳性率为0.4％;第二是以MTB H37Rv基因组为模板，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增ispD基因，连接进入表达载体pET28a(+)，转化E.coli BL21(DE3)pLysS，构建结核分枝杆菌2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸-胞嘧啶转移酶（Mycobacterium tuberculosis2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，MtIspD）重组表达菌株，诱导表达和分离纯化MtIspD，建立和优化MtIspD酶活测定方法，构建MtIspD酶抑制剂筛选模型，应用该模型从具有抗结核活性的化合物中筛选得到5个MtIspD的抑制剂，其中的阳性化合物IMB-4901对MtIspD及MTB均有较强的抑制活性，对MtIspD的IC50为19.3μg/ml，对MTBH37Rv的MIC为1.6μg/ml;酶动力学研究表明，化合物IMB-4901是底物MEP和CTP竞争性抑制剂，Ki分别为24.9μg/ml和15.1μg/ml;抗菌谱测定结果表明，IMB-4901选择性的作用于革兰氏阳性菌，特别是对MTB有很强的选择性抑制作用;IMB-4901对非洲绿猴肾细胞(Vero)和人肝癌细胞(HepG2)有一定的毒性，其TC50分别为1.8μg/ml和1.9μg/ml;第三是以pET28a(+)∷ispD为模板，克隆ispD基因的前320 bp，构建可在MTB中可控表达MtIspD的质粒，为最终获得可控表达MtIspD的MTB突变菌株，确认IMB-4901的作用靶标奠定基础。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

实验材料与仪器

1 菌株及细胞

2 基因组和质粒

3 培养基

3．1 E．coli培养基

3．2 分杆杆菌培养基

3．3 其他菌株药敏实验所用培养基

3．4 Vero和HepG2培养基

4 主要试剂

5 溶液

5．1 抗生素溶液

5．2 蛋白相关溶液

6 试剂盒

7 工具酶

8 主要仪器

实验方法

1 基于MTB的表型筛选

1．1 化合库中样品的初筛

1．2 化合物样品的拆分及复筛

2 MtIspD酶抑制剂的筛选

2．1 ispD基因的扩增

2．2 表达载体的构建

2．3 表达菌株的构建

2．4 MtIspD蛋白的诱导表达

2．5 MtIspD蛋白纯化及蛋白质含量测定

2．6 MtIspD蛋白的定量

2．7 MtIspD蛋白的SDS-PAGE电泳检测

2．8 MtIspD活性测定原理及方法

2．9 MtIspD酶活性测定体系优化

2．10 MtIspD抑制剂筛选模型的确立

3 抑制剂半数抑制浓度(IC50)测定

4 抑制剂的体外抗结核活性测定

5 抑制剂抗菌谱活性测定

6 化合物IMB-4901对MtIspD的动力学研究

7 化合物IMB-4901的细胞毒性研究

8 MtIspD可控表达菌株的构建

8．1 构建MtIspD可控表达菌株的目的及意义

8．2 MtIspD可控表达质粒构建流程

8．3 ispD基因前320bp的获得

8．4 PCR产物的纯化

8．5 纯化的PCR产物双酶切处理及回收

8．6 pAZI 9479的双酶切处理及片段回收

8．7 酶切后ispD前320bp与pAZI9479连接

8．8 连接产物转化DH5α感受态细胞

8．9 阳性克隆鉴定

8．10 阳性克隆质粒的提取

8．11 重组质粒测序

8．12 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv

实验结果

1 基于MTB(H37Rv)表型筛选抗结核活性化合物

2 MtIspD酶抑制剂的筛选

2．1 表达质粒pET28a(+)：：ispD的构建与验证

2．2 MtIspD蛋白的制备

2．3 酶活力测定

2．4 酶活测定体系的优化

2．5 MtIspD抑制剂筛选模型

2．6 MtIspD抑制剂的筛选

3 MtIspD抑制剂对H37Rv的最低抑菌浓度(MIC)

4 MtIspD抑制剂的抗菌谱

5 化合物IMB-4901对MtIspD的抑制动力学研究

6 化合物IMB-4901对肝肾细胞毒性研究

7 MtIspD可控表达菌株的构建

7．1 ispD基因前320bp片段的获得

7．2 纯化的PCR产物双酶切

7．3 pAZI 9479的双酶切

7．4 阳性克隆菌落PCR鉴定

7．5 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp测序

7．6 重组质粒pAZI 9479：：ispDqian320bp电转入H37Rv

讨论

结论

致谢

参考文献

文献综述 细胞壁相关的抗结核药及其靶标研究进展

附录