我国107株新生/格特隐球菌的基因型特点及DiversiLab系统在基基因分型中的应用

摘要

[目的]分析我国107株新生/格特隐球菌的基因型特点，包括84株临床株和23株环境株，同时验证DiversiLab系统用于新生隐球菌和格特隐球菌基因分型的可行性。
　　[方法]回顾性分析2007年至2013年我院与北京地坛医院76例隐球菌患者的性别、年龄、来源地、发病时间、基础疾病等临床资料。收集其中一例系统性红斑狼疮患者曾去过家庭(H1)的鸽粪标本中的新生隐球菌分离株，并采集距离H1约10公里的另一养鸽家庭(H2)的鸽粪标本中的新生隐球菌分离株作为对照。使用CHROMagar显色培养基、API20C AUX、Vitek2 Compact等常规方法对从上述患者临床标本中分离的84株隐球菌以及从H1、H2鸽粪中分离出的23株新生隐球菌进行菌种鉴定，然后用CGB培养基筛选格特隐球菌。使用血清型特异性引物、交配型引物进行血清分型及交配型鉴定。使用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增所有菌株的rDNA ITS。使用URA5-RFLP对上述菌株初步基因分型后，进一步PCR扩增上述菌株的CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1和URA5等7个基因，进行多位点序列分型(MLST)。ITS及MLST7个基因的PCR扩增产物均进行双向测序。使用MEGA6.06软件将测试菌株与新生/格特隐球菌参考菌株MLST7个基因的串联序列同时比对并构建分子进化树。选择DiversiLab系统Fungal试剂盒对测试菌株和新生/格特隐球菌的标准菌株进行rep-PCR，使用微流体芯片对rep-PCR扩增产物电泳分离DNA片段，进一步使用DiversiLab软件V3.4.40分别进行分类和分型分析。并使用DiversiLab系统对2株同时从该病人脑脊液中分离的新生隐球菌(PU66和PU112)进行溯源分析。
　　[结果]在国际上首次使用DiversiLab系统对84株新生/格特隐球菌临床株（包括82株新生隐球菌和2株格特隐球菌）、23株新生隐球菌环境株以及9株新生隐球菌和格特隐球菌的标准菌株共计116株隐球菌进行了基因分型，除1新生隐球菌临床株VNB基因型鉴定有分歧外，其余115株新生/格特隐球菌通过DiversiLab系统分型的结果与MLST及URA5-RFLP的分型结果完全一致;发现了我国乃至亚洲首例VNB基因型新生隐球菌;在我国属于温带气候的华北地区首次发现了格特隐球菌。
　　76例隐球菌病患者分别来自我国15个省份和3个直辖市，20例HIV患者的病死率为30％，10例系统性红斑狼疮患者的病死率为40％，11例患者无明显基础疾病，100％存活。84株隐球菌临床株中有82株新生隐球菌和2株格特隐球菌。82株新生隐球菌中有1株为杂合子，血清型为AD型，其余全为A血清型;杂合子为VNⅢ基因型，另有1株VNB基因型，其余80株为VNⅠ基因型(95％)，为最常见基因型;77株(91.6％)新生隐球菌的MLST序列型为ST5，其次还有ST31、ST63、ST265、ST295、ST296各1株，其中ST265、ST295和ST296是新MLST序列型。2株格特隐球菌的血清型为B/C型，基因型分别为VGⅠ和VGⅡ，MLST序列型为ST182和ST332，其中ST332为新序列型。杂合子的交配型为α/α交配型，其余83株新生/格特隐球菌临床株的交配型全部为α交配型。23株新生隐球菌环境株全为A血清型，α交配型，VNⅠ基因型。来自H1家庭鸽粪中的11株新生隐球菌及2株临床株均属于VNⅠc基因型，MLST序列型除PU112为ST265外均为ST5。而H2家庭鸽粪中分离的12株新生隐球菌均为VNⅠb基因型，MLST序列型为ST31(n=11)和ST297(n=1)。ST297为新MLST序列型。基于ITS序列构建的分子进化树显示VNⅠ、VNⅡ与VNB聚类在一起。基于IGS序列构建的进化树显示PU146与WM626（VNⅡ，标准菌株）聚类，但PU146经URA5-RFLP及MLST分析均为VNⅠ。所有测试菌株及新生/格特隐球菌标准菌株使用DiversiLab系统现有的酵母菌和丝状真菌数据库分类的结果显示与最匹配菌株的相似性均低于80％。PU157被MLST分型为VNB，而URA5-RFLP的结果为VNⅡ，DiversiLab的分析结果更接近VNⅠ。另外，MLST不能分析AD血清型（杂合子），但DiversiLab系统分型分析能够鉴别PU43（AD血清型，临床株）与WM628（AD血清型，标准菌株），并能与其它7种基因型区分开来，其余测试菌及新生/格特隐球菌标准菌株的DiversiLab分型结果与URA5-RFLP、MLST的分型结果完全一致。DiversiLab分析显示PU66与PU112的相似性为96.7％，并有多处峰的差异。PU66与PU70同源性最高，相似性为99.3％，而所有环境株与PU112的相似性均低于98.6％。
　　[结论]DiversiLab系统可快速而准确地对新生/格特隐球菌进行基因分型;新生隐球菌VNⅠ基因型是我国新生/格特隐球菌最为常见的基因型，但我国临床上和环境中的新生/格特隐球菌的基因型分布特点有待深入而全方位地进一步调查;URA5-RFLP不能区分VNB与VNⅡ基因型;ITS、IGS序列分析可以区分新生隐球菌和格特隐球菌，但不能区分新生隐球菌的VNⅠ、VNⅡ和VNB基因型;艾滋病、系统性红斑狼疮等免疫缺陷患者感染新生隐球菌的病死率较高，而无基础疾病人群的感染机制有待进一步研究;同一份临床标本中分离的不同形态的新生/格特隐球菌应同时进行基因分析。

目录

摘要

前言

第一部分 我国107株新生／格特隐球菌的基因型特点

材料和方法

结果

讨论

第二部分 DiversiLab系统在新生／格特隐球菌基因分型中的应用

材料和方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述

附录一 英文缩写词

附录二 发表论文

致谢

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