基于CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系

摘要

Ⅱ型CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别目标基因组序列，介导Cas9对DNA进行切割，从而引入DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)。非同源末端结合(non-homologous end joining，NHEJ)方式修复DSBs易发生基因突变从而实现特定基因的敲除。肿瘤细胞需要有维持端粒长度的机制来实现无限分裂。
　　研究表明约85％的肿瘤依赖端粒酶的激活，15％的肿瘤则依赖端粒的替代延长机制(alternativelengthening telomeres，ALT)通过同源重组的方式维持端粒长度。胰腺内分泌细胞瘤、脑胶质细胞瘤等多种肿瘤细胞中发现ATRX基因失活与端粒的替代延长机制紧密相关。为进一步揭示ATRX在ALT激活中的作用和ATRX对肿瘤发生的作用，本课题利用CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系。通过Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX的表达和Sanger测序在DNA水平鉴定ATRX基因序列突变，成功建立了ATRX基因敲除的HeLa细胞系。

目录

摘要

一、前言

1．1． CRISPR／Cas9基因编辑技术

1．2． ATRX基因与端粒的替代延长机制

二、实验内容

三、实验内容流程图

四、实验方法

4．1 构建识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体(pLenti-sgRNA-Lib)

4．2 慢病毒滴度测定方法(流式细胞仪计数法)

4．3 细胞培养相关实验方法

4．4 细胞感染实验方法

4．5 HeLa单克隆细胞分选方法

4．6 T7核酸内切酶Ⅰ(T7 Endonuclease Ⅰ，T7E1)酶切实验方法

4．7 ATRX基因sgRNA切割位点Sanger测序

4．8 BCA方法测定蛋白浓度

4．9 Western-blot实验方法

五、实验仪器、试剂和材料

5．1．质粒载体

5．2．感受态菌株

5．3．细胞

5．4．细胞培养试剂

5．5．PCR主要试剂

5．6．Western-blot主要试剂

5．7．主要试剂盒

5．8．主要仪器设备

5．9．主要溶剂配方

5．10．本实验设计的5组ATRX基因sgRNA目标序列

5．11．根据5组ATRX基因sgRNA目标序列设计合成的sgRNA接头序列

5．12．T7E1实验PCR扩增ATRX sgRNA目标序列的引物设计

六、结果与分析

6．1．sgRNA重组质粒测序结果

6．2．慢病毒颗粒滴度检测结果

6．3．sgRNA重组载体感染HeLa细胞的荧光显微镜观察照片

6．4．T7核酸内切酶Ⅰ(T7E1)酶切实验结果

6．5．Western-blot鉴定ATRX蛋白表达水平的实验结果

6．6．编号#21的HeLa细胞株ATRX基因Sanger测序结果

七、讨论

7．1．关于ATRX基因靶序列的选择

7．2．识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体的构建

7．3．sgRNA重组慢病毒载体感染细胞

7．4．T7E1实验初步鉴定5组sgRNA介导的CRISPR／Cas9系统对ATRX目标序列的切割效率

7．5．Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX敲除的实验结果

7．6．Sanger测序在DNA水平分析ATRX突变机制

7．7．对进一步研究的展望

参考文献

综述

致谢

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