石斛、北豆根、肉桂的DNA条形码鉴定及铁皮石斛叶绿体基因组研究

摘要

DNA条形码自提出以来，经过十余年的发展，技术体系日渐成熟，在中药鉴定方面的应用也越来越广泛。本研究对石斛、北豆根、肉桂及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究，并结合铁皮石斛叶绿体基因组进行了珍稀濒危石斛属DNA条形码序列筛选研究。主要研究结果如下:
　　(1)考察ITS2序列对石斛属40种、173份样品的鉴定能力，结果表明本研究设计的DOF/R引物可以实现铁皮石斛药材ITS2序列的扩增和测序，石斛属ITS2序列种内变异小于种间变异，鉴定效率为75.72％和61.27％（BLAST和NearestDistance方法），能实现对石斛属大部分物种的准确鉴定。
　　完成铁皮石斛叶绿体基因组二代测序、物理图谱绘制，基因组结构特征解析，基因功能分类，密码子使用情况及微卫星序列分布等，结合已公布的兰科叶绿体基因组，筛选分子鉴定候选序列。结果发现petA-psbJ和psbK-psbI序列种间变异大，种内相对保守，可以实现物种的准确区分，可作为分子鉴定的候选DNA条形码序列。
　　根据叶绿体基因组分析结果，对17种石斛的34份样品进行psbK-psbI序列扩增，验证psbK-psbI序列对石斛属的鉴定能力。结果发现psbK-psbI序列在石斛属内的扩增效率和测序效率均为100％，且psbK-psbI序列在石斛属种内保守，种间变异明显，能够区分石斛属内物种。
　　(2)应用ITS2和psbA-trnH序列对北豆根及其混伪品共49份样品进行鉴定研究，其中包括16份药材市场中收集的商品药材。结果表明所有样品均成功提取DNA，ITS2和psbA-trnH扩增效率均为100％，测序效率分别为100％、76.5％，鉴定效率均为100％，NJ树结果显示能够区分北豆根药材及其混伪品;所有商品药材经鉴定均为正品。因此，ITS2和psbA-trnH序列可以对北豆根药材及其混伪品进行鉴定，是保障用药安全和维护药材市场规范的有力手段。
　　(3)基于psbA-trnH序列对肉桂及混伪品共59份样品进行鉴定研究。结果表明肉桂psbA-trnH序列长度368 bp，种间K2P遗传距离明显大于种内K2P遗传距离，NJ树结果显示肉桂能与近缘物种区分开。基于psbA-trnH序列的DNA条形码技术能够准确鉴定肉桂及其相关近缘种，保障药食同源物种的规范用药。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 中药鉴定方法的起源

1．2 基于理化性质分析的蓬勃发展期

1．3 基于核酸信息的分子鉴定期

1．4 展望

第二章 石斛及其混伪品DNA条形码鉴定及铁皮石斛叶绿体基因组研究

2．1 石斛及其混伪品ITS2序列鉴定研究

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果及分析

2．1．3 讨论

2．2 铁皮石斛叶绿体基因组测序、分析及DNA条形码筛选

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果与讨论

2．2．3 小结

2．3 基于psbK-psbI候选序列的石斛属部分物种及其混伪品鉴定研究

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3．3 讨论

2．4 结论

第三章 北豆根及其混伪品DNA条形码鉴定研究

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 PCR扩增、测序效率及序列特征

3．2．2 种内种间遗传距离分析及物种鉴定

3．3 讨论

3．3．1 psbA-trnH序列poly结构对测序效率的影响

3．3．2 ITS2多拷贝现象与鉴定效率

3．3．3 DNA条形码鉴定对北豆根及其混伪品鉴定的稳定性及准确性

3．3．4 DNA条形码技术在药材流通市场监管中的应用

3．4 结论

第四章 肉桂及其混伪品DNA条形码鉴定研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 PCR扩增与测序效率

4．2．2 肉桂及其混伪品种内种间变异分析

4．2．3 肉桂及其混伪品的NJ树鉴定

4．3 讨论

4．3．1 皮类药材DNA提取

4．3．2 psbA-trnH序列可以实现肉桂药材及其混伪品的准确鉴定

4．3．3 DNA条形码分子鉴定在监管药食同源物种中的应用前景

4．4 结论

参考文献

致谢

个人简历