基于多肽构建抗肿瘤靶向药物的应用研究

摘要

第一部分、多西紫杉醇偶联Hsp90抑制肽靶向药物抗非小细胞肺癌作用研究
　　目的：以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象，设计合成多西紫杉醇偶联Hsp90抑制肽靶向药物，并探讨其抗非小细胞肺癌作用，为其临床转化研究提供理论和实验依据。
　　方法：采用固相多肽合成方法构建多西紫杉醇偶联Hsp90抑制肽靶向药物(DTX-P7)，并使用HPLC、质谱对DTX-P7进行分析。采用皮下移植造模方法，接种A549细胞8×105/100μl于裸鼠右前肢腋窝皮下制备人非小细胞肺癌裸鼠皮下移植模型。待肿瘤形成且体积达到100mm3时，将30只裸鼠随机分成Control组、DTX组、DTX-P7组，给药剂量按DTX浓度为10mg/kg,每周给药1次，共给药4周。每周2次观察裸鼠的状态，测量肿瘤的长径与短径，计算出肿瘤体积与相对肿瘤体积，记录统计裸鼠的体重变化。第5周，处死裸鼠，分离裸鼠右前肢腋窝皮下的肿瘤组织，称量肿瘤的重量。一部分肿瘤组织置于4％多聚甲醇保存，作石蜡切片，并用HE染色观察肿瘤组织的病理状态。一部分肿瘤组织提取蛋白，探讨DTX-P7对Hsp90的表达及细胞自噬相关蛋白的影响。
　　结果：我们制备并得到了DTX-P7，所用的色谱条件符合实验要求，质谱分析结果图中m/z=839.50为[M+H+K]2+峰，对应分子量为839.50×2-1.01-39.10=1638.89，与计算单同位素分子量1638.83相符。体内动物实验，各组动物在给药期间的体重稳定无明显差异，且心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑等重要器官均未出现肉眼可见的明显损伤。与Control组、DTX组相比，DTX-P7组裸鼠的相对肿瘤体积、肿瘤重量都有显著性减小，表明DTX-P7具有显著的抗非小细胞肺癌作用。与对照组相比，DTX和 DTX-P7组的肿瘤组织的HE染色切片出现大量粉红色淡染并且无细胞结构的肿瘤坏死区域，DTX-P7组坏死情况比DTX更为严重，表明DTX-P7对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用。
　　结论： DTX-P7体内对非小细胞肺癌有显著的治疗作用，有望成为一种新颖的肺癌治疗候选药物。
　　第二部分、靶向肽细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米药物的构建及胶质瘤治疗初步研究
　　目的：以人胶质瘤U251细胞为研究对象，制备靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒并探讨其对胶质瘤的治疗作用。
　　方法：运用噬菌体展示技术进行三轮淘选，筛选出与能人胶质瘤U251细胞特异性结合的多肽，通过免疫组化的方法验证其靶向性。用可生物降解的PLGA作为载体材料，采用界面沉淀法制各PLGA紫杉醇纳米粒。然后通过酰胺缩合反应将靶向肽HC、细胞穿膜肽TAT连于纳米粒表面，制备靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒，并对其进行表征，用动态光散射仪测定粒径、Zeta电位，高效液相色谱测定载药量，透射电子显微镜观察形貌等。通过体外药物释放实验探讨靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒对药物释放的影响，并通过细胞增殖实验探讨其对人胶质瘤U251细胞的细胞毒性作用。
　　结果：我们筛选出能与U251细胞特异性结合的多肽HC，用免疫组化方法验证得到其靶向性良好，可以作为靶向肽。所制备的靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒的粒径分布比较集中，平均粒径为350.5±31.8nm，多分散系数为0.224±0.034，Zeta电位值为-31.9±5.0mV，载药量为6.49％，纳米粒基本呈大小较均匀的类圆球形。在紫杉醇浓度相同的1-100nM范围内，靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒对细胞的杀伤作用优于传统药物紫杉醇。
　　结论：筛选得到的靶向肽特异性良好，制各的靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米粒性质稳定，具有一定的缓释作用，在细胞水平对胶质瘤细胞有杀伤作用，为进一步实验提供了思路。

目录

缩略词表

摘要

第一部分 多西紫杉醇偶联Hsp90抑制肽靶向药物抗非小细胞肺癌作用研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分 靶向肽-细胞穿膜肽双修饰的PLGA紫杉醇纳米药物的构建及胶质瘤治疗作用初步研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述 多肽及其衍生物的抗肿瘤作用研究进展

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致谢

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