野生和人工繁育树鼩CD4以及Il-6分子的克隆与分析

摘要

树鼩(Tupaia belangeri，tree shrew)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩目的小型动物，形态酷似松鼠，与人类有较近的亲缘关系。由于其体型小、易驯化、繁殖周期短、饲养管理成本低等优点，自上世纪80年代开始，就被相继用于多种人类感染性疾病模型的建立，如肝炎病毒感染模型、手足口病模型等。但是，目前尚缺乏树鼩免疫相关分子背景基因的研究。而在病毒感染过程中，CD4分子作为T细胞受体识别抗原复合物，在抗感染免疫中发挥重要的作用。而IL-6作为Th2型细胞因子，在抗感染过程中是主要的促炎症细胞因子。它可以刺激多种细胞增殖、分化，并在机体免疫应答、骨髓造血、自身免疫和机体防御等方面均起着重要作用。因此，我们克隆分析了野生型、人工繁殖子一代以及人工繁殖子二代中缅树鼩中CD4以及IL-6分子核苷酸和氨基酸序列的多态性以及重要的功能位点。比较分析野生型和人工繁育树鼩的CD4及IL-6分子的碱基及氨基酸的差异，为实验树鼩封闭群和人类感染性疾病树鼩动物模型建立提供基本参数。
　　通过分离树鼩外周血淋巴细胞，经植物血凝素（PHA）刺激24小时后提取细胞总RNA，RT-PCR扩增得到长度分别为1365bp的CD4和627bp的IL-6全长编码序列。测序分析发现，在野生型树鼩中，不同个体树鼩的CD4以及IL-6分子有不同程度的碱基和氨基酸位点的突变，但是分别有35％和26.7％的碱基突变是同义突变，且非同义突变的位点对树鼩CD4和IL-6分子重要的功能位点没有影响。因此，在野生型树鼩中，CD4和IL-6分子具有重要功能的氨基酸位点是保守稳定的。而在人工繁殖子一代树鼩中，CD4分子发生碱基同义突变的频率为40.7％，IL-6分子为41.2％。在人工繁殖子二代树鼢中，CD4分子发生碱基同义突变的频率为50.0％，IL-6分子为27.3％。所以我们可以看出，在人工繁殖树鼩中，CD4以及IL-6分子发生同义突变的频率均比野生型树鼩中相应的分子发生频率相对较高。因发生碱基的同义突变时，所编码的氨基酸保持不变，因此不产生突变效应。结果表明了人工繁育树鼩将会有效的降低树鼢个体之间的差异。而且子人工繁殖树鼩中，CD4以及IL-6分子中的重要的氨基酸位点也均是稳定不变的。本研究将为今后树鼩CD4和IL-6单克隆抗体的制备和树鼩实验动物模型的建立奠定基础。

目录

摘要

引言

1 树鼩基本概况

1．1 树鼩的生物学概况

1．2 树鼩的分类地位以及作为新型实验动物的特征

2 树鼩病毒感染动物模型

2．1 病毒性肝炎树鼩动物模型

2．2 手足口病树鼩动物模型

3 细胞膜表面分子CD4以及细胞炎症因子IL-6的分子特征及研究意义

3．1 CD4

3．2 IL-6

3．3 CD4和IL-6分子基因分型的意义

第一部分 野生型树鼩CD4以及IL-6分子全长编码序列的克隆及分析

1．研究目的及意义

2．材料和方法

2．1 实验动物

2．2 菌种与质粒

2．3 主要试剂及材料

2．4 主要仪器设备

2．5 引物设计

3．实验方法

3．1 树鼩外周血淋巴细胞的分离与刺激培养

3．2 树鼩外周血淋巴细胞总RNA的提取

3．3 总RNA逆转录为cDNA

3．4 PCR扩增目的基因全长编码序列

3．5 琼脂糖凝胶电泳

3．6 PCR产物的纯化

3．7 受体菌DH5a的感受态制备

3．8 纯化产物连接于pMD19-T载体

3．9 转化感受态细胞DH5a

3．10 阳性重组质粒的提取

3．11 酶切鉴定目的片段

3．12 数据分析

4．实验结果

4．1 PCR条件优化结果

4．2 CD4及IL-6全长编码序列的PCR扩增

4．3 PCR产物胶回收

4．4 重组质粒pMD19-T的构建与双酶切鉴定及测序

4．5 树鼩CD4分子基因序列及氨基酸序列进化树的构建

4．6 树鼩CD4分子基因序列与氨基酸序列突变对比

4．7 树鼩IL-6分子基因序列及氨基酸序列进化树的构建

4．8 树鼩IL-6分子基因序列与氨基酸序列突变对比

5 分析与讨论

6 小结与展望

第二部分 人工繁育树鼩CD4以及IL-6全长编码基因克隆与分析

1 研究目的及意义

2 实验材料和方法

3 实验结果

3．1 CD4及IL-6全长编码序列的PCR扩增

3．2 PCR产物胶回收

3．3 重组质粒pMD19-T的构建与双酶切鉴定及测序

3．4 F1代及F2代中缅树鼩CD4分子基因序列及氨基酸序列突变对比

3．5 F1代及F2代中缅树鼩IL-6分子基因序列及氨基酸序列突变对比

4 分析与讨论

5 小结及展望

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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