组蛋白变体macroH2A分子伴侣的筛选

摘要

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在于细胞核中。核小体是染色质的结构单元，由147 bp DNA缠绕组蛋白八聚体组成。组蛋白变体作为重要的表观遗传调控因子，可以调控基因组相关的生物学功能。
　　MacroH2A是常规组蛋白H2A的变体，它具有特殊的macro domain，分子量是其它组蛋白的三倍。MacroH2A的功能多与基因沉默有关，在X染色体失活、胚胎发育、肿瘤发生中发挥了重要作用。组蛋白分子伴侣可以与组蛋白结合，促进组蛋白转移，但不参与构成终产物。组蛋白分子伴侣参与了组蛋白合成、加工、转运、贮存、代谢，是组蛋白发挥功能的重要条件。以往对macroH2A的研究大多集中于其的生物学功能，而对其分子伴侣所知甚少。
　　我们采用筛选组蛋白分子伴侣经典方法:串联亲和纯化（TAP）技术，在细胞核提取物（nuclear extracts，NE）中验证可能的分子伴侣Y与H2A-H2B存在相互结合作用。
　　本实验采用同样的方法筛选组蛋白变体macroH2A的分子伴侣。利用稳定表达macroH2A的HEK293T细胞制备的NE中存在大量染色质污染。我们改用染色质结构更稳定的HeLa S3细胞执行上述操作，得到了同样的结果。我们推测这种现象可能与macro domain有关。我们选取了不含有macro domain同时又能顺利入核形成完整核小体的macroH2A删截体进行实验，仍无改善。我们从胞质提取物(cytosolicextracts，CE)中筛选多个macroH2A可能分子伴侣，可能与macroH2A加工、转运入核有关。
　　综上所述，本人用经验证有效的TAP方法从胞质提取物中筛选出多个macroH2A可能分子伴侣。在从NE中筛选macroH2A分子伴侣的过程中优化了TAP方法。

目录

摘要

前言

1．1 经典遗传学

1．1．1 遗传学发展简史

1．2 表观遗传学

1．2．1 表观遗传学发展简史

1．2．2 表观遗传学调控机制

1．3 MaeroH2A的结构与功能

1．3．1 MacroH2A结构特性

1．3．2 MaeroH2A功能特性

1．4 组蛋白分子伴侣

1．5 本文的研究目的和科学意义

材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞株和菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要耗材

2．1．5 主要仪器

2．1．6 常用溶液

2．2 实验方法

2．2．1 真核表达质粒的构建

2．2．2 质粒DNA大量提取(CsCl超速离心纯化DNA)

2．2．3 细胞培养无菌操作技术

2．2．4 细胞冻存及复苏

2．2．5 细胞计数

2．2．6 质粒感染与慢病毒包装

2．2．7 稳定细胞系的筛选

2．2．8 稳定细胞系的鉴定

2．2．9 细胞扩大培养

2．2．10 串联亲和纯化(TAP)

2．2．11 银染

2．2．12 染色质免疫共沉淀(CHIP)

实验结果

3．1 可能分子伴侣Y的TAP法验证

3．2 从NE中筛选macroH2A分子伴侣

3．2．1 从HEK293T中筛选macroH2A分子伴侣

3．2．2 从HeLa S3中筛选macroH2A分子伴侣

3．2．3 选用删截体筛选macroH2A分子伴侣

3．3 从胞质提取物(CE)中筛选macroH2A分子伴侣

结论

讨论

参考文献

致谢

个人简历

声明