中国人群中桦树花粉变应原谱分析及Bet v1表面特异性IgE/IgG4结合位点的研究

摘要

桦树花粉是我国北方地区春季主要致敏花粉之一。现已鉴定的桦树花粉变应原包括Bet v1，Bet v2，Betv3，Bet v4，Bet v6，Bet v7和Bet v8。Betv1在中欧地区人群中的血清IgE反应阳性率高达98％以上，且约60％的血清IgE仅识别Bet v1，故被认为是桦树花粉主要变应原。基于不同人群的桦树花粉变应原研究发现，不同地区桦树花粉过敏患者血清IgE对花粉中各个变应原组分的反应性不完全相同。迄今为止，尚未见有关中国人群中桦树花粉变应原谱的研究。Bet v1是目前被研究最为深入的变应原之一，有关其基因编码序列、氨基酸序列、蛋白质三维结构以及与各种同源变应原间的交叉反应性现已有大量文献报道。但是，关于Betv1分子表面IgE表位分布的信息还不明确。
　　本研究将对141例中国桦树花粉过敏（118例）或致敏（23例）患者临床资料进行分析，以总结该花粉中各变应原反应谱及其相关食物过敏谱。结果显示，74.5％的桦树花粉症患者仅表现为过敏性鼻炎，哮喘或鼻炎合并哮喘者约为20.3％。在桦树花粉过敏过敏组，rBetv1(t215) ImmunoCAP检测阳性率为77.1％，rBetv2(t216)为39.6％，rBet v4(t220)为4.8％，rBet v6(t225)为0％。而致敏组中，上述各桦树花粉变应原阳性率依次为43.4％，56.5％，4.3％和0％。过敏组rBet v1阳性率明显高于致敏组。73.7％的桦树花粉过敏/致敏患者合并花粉相关食物过敏，其中72.9％的食物过敏仅表现为口腔变态反应综合征;8.1％表现为严重过敏反应;6.7％表现为哮喘;1.3％为皮肤症状，剩余12.1％的患者在进食同一过敏食物时可表现为口腔变态反应综合征或严重过敏反应。最常合并的过敏食物是桃（41例），其次为苹果（35例）、榛子（23例）、梨（15例）、樱桃（14例）等，均为Betv1相关的植物性食物。统计学分析发现合并食物过敏的桦树花粉症患者花粉症发病年龄明显高于非食物过敏者（31.0±14.9岁 vs25.3±14.12岁， p＜0.05），其rBet v1(t215)明显较高（31.43±32.49kUA/l vs18.85±29.64kUA/l， p＜0.05），且合并食物过敏组女性患者及伴有特应性疾病家族史的患者均明显多于非食物过敏组。
　　本研究使用41份桦树花粉症患者血清对该花粉水溶蛋白进行免疫印迹实验，发现60.9％(n=25)的血清IgE可以与Betv1结合，51.2％(n=21)的血清可以与1条分子量在72kDa的蛋白结合。有关桦树花粉中这一72kDa蛋白尚无文献报道。免疫抑制实验证实该72kDa蛋白与Bet v1间不具有交叉反应性。通过离子交换层析和凝胶过滤层析对该72kDa蛋白进行分离纯化，获得了单一分子量蛋白条带;进一步的等电聚焦电泳结果显示该蛋白等电点约为6.5。在同一分子量、相近的的等电点范围内，该蛋白被分离得到4个蛋白质点，且这4个点均具有IgE反应性，推测可能为其异构体。
　　应用Betv1-Apig1嵌合体在42例中国桦树花粉致敏或花粉症患者中定位Betv1分子表面IgE和IgG4的结合位点。该嵌合体是将Bet v1.0101分子表面4个特定区域移植到其低变应原性同源物Api g1.0101上构建而成。通过ELISA检测患者血清中IgE和IgG4对这4种嵌合体的结合情况，以分析Bet v1.0101分子表面IgE和IgG4结合位点。结果显示，88％的患者血清可以同时
　　Betv1分子表面2个或2个以上区域，且不同患者对4种嵌合体Api-Bet-1、Api-Bet-2、Api-Bet-3和Api-Bet-4的IgE和IgG4反应谱具有个体化差异。其中P-loop基序对侧表面区域以及C末端区域是IgE和IgG4阳性结合率最高的区域。而P-loop基序在我国患者血清中IgE和IgG4反应性较低，且几乎不能增强抗体对Api g1.0101的识别能力。尽管由于Bet v1特异性IgE和IgG4与其表面区域呈多样化结合，致使应用单克隆抗体对桦树花粉症患者进行免疫治疗难以实现，但是IgE结合位点的定位研究可以帮助研发低致敏性脱敏疫苗。
　　综上，本研究是第一个在中国人群中对桦树花粉变应原谱进行分析的大样本研究。根据ImmunoCAP检测及免疫印迹实验结果证实Bet v1在中国人群中是桦树花粉主要致敏蛋白。本研究在中国桦树花粉症患者中首次发现了另一血清结合率大于50％的花粉蛋白，其分子量约为72kDa，等电点约为6.5，为桦树花粉中又一新的主要致敏蛋白。Betv1分子表面P-loop基序对侧表面区域以及C末端区域是IgE和IgG4的主要结合位点。

目录

摘要

第一部分 桦树花粉变应原及其相关食物致敏谱分析

1 前言

2 研究对象和方法

2．1 研究对象

2．2 血清sIgE检测

2．3 皮肤点刺实验

2．4 统计学分析

3 结果

3．1 研究对象基本情况

3．2 rBet v 1、rBet v2、rBet v 4和rBet v 6阳性率

3．3 桦树花粉过敏患者合并其他花粉致敏谱

3．4 桦树花粉相关食物过敏临床特点及食物过敏谱

3．5 桦树花粉相关食物变应原特点

3．6 Ara h 8、Gly m 4、Cor a 1以及Pru P 1在花生、大豆、榛子及桃过敏中的诊断价值

4 讨论

5 小结

第二部分 中国花粉症患者中桦树花粉主要变应原研究

1．前言

2．研究方法

2．1 研究对象

2．2 实验材料和试剂

2．3 仪器和设备

2．4 桦树花粉水溶性蛋白提取及浓度测定

2．5 桦树花粉水溶蛋白SDS-PAGE分析

2．6 桦树花粉蛋白免疫印迹

2．7 免疫印迹抑制实验

2．8 离子交换层析(Cation exchange chromatography)

2．9 CON A凝胶层析(Gel filtration chromatography)

2．10 等电聚焦电泳及免疫印迹

3 结果

3．1 中国和欧洲白榫花粉水溶蛋白SDS-PAGE分析

3．2 桦树花粉水溶蛋白免疫印迹分析

3．3 免疫印迹抑制实验

3．4 72kDa蛋白条带分离纯化

3．5 等电聚焦电泳及免疫印迹

4 讨论

5 小结

第三部分 Bet v 1-Api g 1嵌合体在中国桦树花粉症患者中IgE及IgG4杂合反应谱

1 前言

2 研究方法

2．1 研究对象

2．2 研究方法

2．3 统计学分析

3 结果

3．1 入组患者基本情况

3．2 Api-Bet-1、Api-Bet-2、Api-Bet-3和Api-Bet-4血清IgE反应谱

3．3 Bet v 1．0101和Api g 1．0101与4种嵌合体血清IgE反应相关性分析

3．4 Api-Bet-1、Api-Bet-2、Api-Bet-3和Api-Bet-4血清IgG4反应谱

4 讨论

5 小结

参考文献

论文综述 桦树花粉过敏

英文缩略词表

附录

致谢

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