Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性研究及Sabin株病毒深度测序方法的探索

摘要

脊髓灰质炎(Poliomyelitis，以下简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒(PoliomyelitisVirus，PV)感染引起、危害极大的急性传染病，尚无有效治疗方法，只能通过疫苗预防。口服脊灰减毒活疫苗(Oral Poliomyelitis Vaccine，OPV)因接种方便，成本相对较低而一度被广泛使用，但可能引起脊灰疫苗相关麻痹病例(Vaccine-AssociatedParalytic Poliomyelitis，VAPP)和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus，VDPV)病例，灭活脊灰疫苗(Inactivated poliomyelitis vaccine，IPV)能有效避免VAPP和VDPV，采用IPV取代OPV是《全球消灭脊灰战略终结计划》的要求。而在全世界消灭脊灰后，采用野毒株(Salk)生产IPV对生物安全水平要求更加严格，因此WHO鼓励疫苗厂家研发Sabin株脊灰灭活疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine，Sabin strain，sIPV)。在研发sIPV过程中，Sabin株毒种的遗传稳定性极其重要。本研究通过检测PV感染性滴度、D抗原含量以及PV全基因组Sanger测序的方法来检测制备的工作种子和疫苗代次病毒的遗传稳定性。
　　此外，生产中在对疫苗质量进行监测时，需区别通过和未通过猴体神经毒力试验(Monkeys Neurovirulence Test，MNVT)的疫苗之间的差别;而采用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析(Mutant Analysis by PCR and RestrictionEnzyme Cleavage，MAPREC)虽然可以准确地测定出一个碱基位点突变的量，但无法实现对基因组每个核苷酸的序列变化都进行监测。随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，第二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)的出现，使得基因检测效率不断提高，从分子水平来监测疫苗质量更容易实现。本研究通过对Sabin株病毒NGS模板制备方法的讨论，探讨了如何去除背景核酸的干扰、低浓度样品的扩增方法选择、样品的纯化定量筛选以及质量鉴定，以及测序平台的选择等问题。
　　目的：1.分析sIPV毒种（亚主种子、工作种子）及疫苗代次病毒(SO+4)、SO+5、SO+6的遗传稳定性;2.初步建立Sabin株病毒NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化筛选方法以及测序平台选择等问题，以期为进一步研究Sabin株的遗传稳定性构建一种切实可行的新方法。
　　方法：1.比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的感染性滴度及D抗原含量的变化情况，并对上述病毒进行全基因组测序;2.采用常用的NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化等方法制备Sabin株病毒NGS测序模板，比较筛选适用Sabin株病毒NGS的最佳组合，并对制备的模板进行定量和质量鉴定。
　　结果：1.各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62～8.62 lgCCID50/ml，D抗原含量均维持在30～128 DU/ml。与GenBank上登录的SabinⅠ(AY184219.1)、Ⅱ型(AY184220.1)及SabinⅢ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比，Sabin株亚主种子(SO+2)、工作种子(SO+3)及疫苗代次病毒(SO+4)、SO+5、SO+6均未出现碱基突变;2.Sabin株病毒NGS模板制备的样品预处理是必要的，选用不依赖序列的单引物扩增效果最好，优化了磁珠纯化法的磁珠用量，且采用Qubit定量系统定量更精确。
　　结论：1.sIPV毒种及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的病毒全基因序列与原始种子相比，均未发生变化，毒力均一，遗传性状方面保持了较好的稳定性;2.初步建立了Sabin株病毒NGS的模板制备方法，并成功制备了Sabin株病毒NGS模板。

目录

摘要

前言

1、Sabin株脊髓灰质炎疫苗毒种遗传稳定性研究的意义及进展

2、Sabin株病毒深度测序的意义及现状

一、实验材料和实验方法

(一)材料和仪器设备

1、细胞

2、脊灰病毒毒种

3、试剂和器材

4、主要仪器设备

5、查询使用的主要生物信息学工具

(二)实验方法

1、细胞培养

2、病毒培养

3、病毒滴度的检测

4、ELISA法测定D抗原含量

5、病毒RNA提取

6、Sanger测序引物设计及合成

7、Sanger测序RT-PCR

8、高保真酶DNA扩增

9、Sanger测序病毒基因序列的分析

10、NGS样品的预处理方法

11、NGS模板的扩增方法

12、NGS模板纯化方法

13、NGS模板定量

14、NGS模板质量鉴定

二、实验结果

(一)sIPV毒种遗传稳定性研究结果

1、不同代次Sabin株的病毒滴度和D抗原含量

2、RNA提取结果

3、Sanger测序RT-PCR产物电泳检测结果

4、Sanger测序全基因序列比对结果

(二)Sabin株病毒深度测序模板制备方法探索结果

1、RNA提取后是否进行DNase Ⅰ消化电泳检测结果

2、NGS模板扩增方法的优化结果

3、NGS模板制备的RT-PCR产物鉴定结果

4、磁珠纯化产物的电泳检测、定量及质量鉴定结果

5、制备模板的完整性检测结果

三、讨论

(一)sIPV毒种遗传稳定性研究

1、sIPV毒种全基因组测序分析

2、sIPV毒种感染性滴度和D抗原含量

3、小结

(二)Sabin株深度测序模板制备方法探索

1、Sabin株病毒NGS样品的预处理

2、Sabin株病毒NGS模板扩增方法

3、Sabin株病毒NGS模板纯化方法

4、Sabin株病毒NGS模板定量

5、Sabin株病毒NGS模板质量鉴定

6、小结

(三)结论与展望

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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