人与小鼠脑组织转录组基因表达与功能比较研究及多巴胺D5受体与胃泌素受体在促尿钠排泄中的协同互作研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 人与小鼠脑组织转录组基因表达与功能比较研究
　　目的：伴随人口老龄化趋势日益加剧，神经退行性疾病已成为影响人类生命健康及生活质量的主要疾病负担。截止目前，这类疾病的病因及发病机制仍不清楚，在临床上也尚无控制病程进展的有效措施。建立理想的动物模型对于探索这类疾病的发病机制及药物筛选十分重要。小鼠因为其体积小，妊娠期短，饲养成本低，基因工程技术相对成熟，大脑解剖结构和生理功能与人类较为接近而成为用于模拟人类神经退行性疾病较为理想的模式动物。构建转基因小鼠的首要问题是要考虑某个感兴趣基因的表达及功能在健康人与小鼠之间是否一致。因此，弄清健康人与小鼠大脑转录组基因表达与功能的相似性及差异性，不仅能为建立神经退行性疾病小鼠模型并评价其有效性和准确性提供参考，也有助于从转录组水平上解释人与小鼠学习记忆与认知能力差异的潜在原因。
　　方法:健康成年人与小鼠前额叶皮层(prefrontal cortex，PFC)、海马(hippocampus，HIP)及纹状体(striatum，STR)的基因(mRNA)表达谱数据来源于GEO数据库。利用Expression Console软件预处理原始数据，RMA算法标准化探针。利用百分位数法挖掘相对高表达基因并通过DAVID软件进行功能富集分析。Venn分析用于描述不同生物学过程(Biological process，BP)节点集的重叠率;R包GOSemSim的mgoSim函数用于GO语义相似性分析。对同源基因的荧光信号校正后利用1-皮尔森相关系数计算表达距离，分层聚类和主成分分析用于表达模式评估。物种特异表达的同源基因通过比较极端数据集的方法挖掘并利用实验验证。Limma算法及百分位倍数变化用于分析差异表达的同源基因，String数据库用于挖掘差异表达同源基因之间的互作关系，Cytoscape软件对网络可视化。分析网络拓扑属性并利用MCODE算法挖掘高连通的功能子网络模块，DAVID软件用于分析网络功能。利用小RNA测序技术检测健康成年人与小鼠海马组织miRNA的表达。原始数据预处理后，鉴定已知成熟的miRNA、其它小RNA及新发现的miRNA。新miRNA的靶基因通过TargetScan算法预测，DAVID软件用于靶基因功能注释。成熟miRNA的表达水平通过TPM(transcripts per million)标准化，利用DIANA-mirPath v3.0软件分析人与小鼠海马富集或特异表达的miRNA功能。Spearman相关系数用于分析两物种海马miRNA的表达模式。相对小鼠，人海马显著差异表达的miRNA通过edgeR算法和倍数变化鉴定。miRanda、Pictar、DIANA-microT以及Targetscan算法用来预测差异miRNA的靶基因，根据反向调节的原则进一步筛选miRNA-mRNA互作关系对。利用Cytoscape软件可视化相对小鼠的人海马差异miRNA-mRNA功能调控网络。
　　结果:人与小鼠对应脑组织高表达基因显著富集的主要BP节点高度一致;显著富集的KEGG通路及其显著性相似;PFC、HIP及STR中同源基因的表达模式在人与小鼠间高度保守。人脑组织高表达基因显著富集的BP节点约为小鼠对应脑组织的两倍;与神经活动相关的BP节点也显著多于小鼠，其中神经元投射的生成与发育为人类特有;脑组织高表达基因功能富集结果中相同BP节点的显著性具有物种特异性;两物种对应脑组织高表达基因显著富集的BP节点重叠率及语义相似性具有明显的物种特异性;COX5B，WIF1，SLC4A10和PLA2G7为鉴定的物种特异表达的同源基因;相对小鼠脑组织，人对应脑组织差异表达的同源基因功能调控网络具有无尺度和小世界属性，存在与神经活动显著相关的子网络功能模块。在人海马组织中新鉴定出一条miRNA，Novel-21-5p，其候选靶基因主要在突触，突触小体，囊泡，突触后密集区，投射神经元上表达，参与了神经递质传递，神经营养信号通路及胶质瘤的发生发展等。miR-9-5p在人与小鼠海马中表达量占比最高。人海马富集表达的前20个miRNA参与了神经营养因子TRK受体信号通路，突触传递及轴突导向等生物学过程。人海马特异表达的miR-656-3p参与了突触传递，神经营养因子TRK受体信号通路，神经元细胞-细胞粘连等生物学过程。人与小鼠海马同源miRNA的表达模式高度保守，表达保守性与序列保守性呈正相关。相对小鼠海马的人海马差异miRNA-mRNA功能调控网络为二分图，其中下调网络与模式规范过程，区域化，前-后模式形成，视觉感知，光刺激的感官知觉等生物学过程相关。
　　结论:本研究发现人与小鼠对应脑组织高表达基因的主要功能相似，人与小鼠海马富集表达的miRNA种类相似;同源mRNA及miRNA表达模式高度保守，这可能是人与小鼠大脑解剖结构及细胞类型保持高度一致的遗传基础，说明在一定程度上小鼠可以准确有效地用于模拟人类神经系统的生理病理过程。然而人脑组织高表达基因功能相对小鼠更加复杂多样;人与小鼠脑组织高表达基因的生物功能趋于物种相似性;两物种间存在差异调控的子网络模块，并与神经生理病理过程相关;人海马中新鉴定的、特异表达的、富集表达的miRNA以及下调miRNA-mRNA功能调控网络均参与了重要的神经生理病理过程。这些结果可为进一步理解人与小鼠神经行为表型差异提供分子遗传基础。
　　第二部分 多巴胺D5受体与胃泌素受体相互作用及其促尿钠排泄效应研究
　　目的:肾脏多巴胺D1样受体（D1R和D5R）及胃泌素受体(CCKBR)在维持机体钠平衡中扮演着重要角色。先前的研究表明D1R与CCKBR在肾近曲小管(renal proximal tubule，RPT)中协同互作，具有促尿钠排泄的作用。相比D1R，D5R具有持续活性，对多巴胺的亲和力更强。因此本研究旨在探索D5R与CCKBR的相互作用及其促尿钠排泄效应。
　　方法:利用免疫印迹技术检测CCKBR配体gastrin、CCKBR特异性抑制剂YF476、gastrin+YF476处理的人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cell line，HK-2)中D5R表达;检测D1R/D5R特异性激动剂fenoldopam、特异性抑制剂Sch23390、fenoldopam+Sch23390处理的HK-2细胞中CCKBR表达;并检测gastrin促进D5R表达以及fenoldopam促进CCKBR表达的时间与剂量依赖效应。利用异源表达人D5R和CCKBR的HEK293细胞(HEK293-D5R-CCKBR)及血压正常人的RPT细胞(NT)验证D5R与CCKBR互作的特异性。利用免疫共沉淀技术检测D5R与CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR细胞中的直接互作效应;利用免疫荧光共定位技术检测D5R与CCKBR在HK-2细胞及BALB/c小鼠RPT中的亚细胞定位。利用免疫印迹技术检测D5R及CCKBR基因敲除(D5R-/-及CCKBR-/-)小鼠肾皮质细胞膜CCKBR及D5R蛋白表达。高盐喂养4月龄雄性BALB/c小鼠2周后分为7组，分别腹腔注射生理盐水、Sch23390、YF476、fenoldopam、gastrin、fenoldopam+YF476及gastrin+Sch23390，每天1次，7天后收集24小时尿液并检测钠和肌酐浓度。
　　结果:D5R与CCKBR在HK-2、HEK293-D5R-CCKBR及NT细胞中协同互作，具有时间与剂量依赖效应。D5R与CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR细胞中共沉淀，在HK-2细胞及BALB/c小鼠RPT中共定位。CCKBR在D5R-/-小鼠肾皮质细胞膜上的表达显著高于D5R+/+小鼠;D5R在CCKBR-/-小鼠肾皮质细胞膜上的表达显著高于CCKBR+/+小鼠。高盐饮食促进了BALB/c小鼠肾皮质细胞膜D5R及CCKBR蛋白表达。CCKBR-/-小鼠相比CCKBR+/+小鼠血压升高，尿钠排泄减少。CCKBR特异性抑制剂YF476及D1R/D5R特异性抑制剂Sch23390能够抑制高盐饮食诱导的尿钠排泄效应;D1R/D5R特异性抑制剂Sch23390能够显著减弱CCKBR配体gastrin诱导的促尿钠排泄效应;CCKBR特异性抑制剂YF476能够显著减弱D1R/D5R特异性激动剂fenoldopam诱导的促尿钠排泄效应。
　　结论:D5R与CCKBR在肾脏中协同互作，在维持高盐饮食后机体钠平衡过程中具有重要作用。

目录

摘要

第一部分 人与小鼠前额叶皮层、海马及纹状体转录组基因表达及功能比较分析

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

1．实验材料

2．试验方法

结果

1．人与小鼠脑组织转录组表达谱数据

2．人与小鼠脑组织高表达基因功能富集分析

3．人与小鼠脑组织高表达基因功能比较

4．人与小鼠回源脑组织基因表达模式分析

5．物种特定脑组织特异表达的同源基因

6．人脑组织DEHGN

讨论

总结

参考文献

第二部分 人与小鼠海马组织miRNA表达及功能比较分析

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

1．实验材料

2．试验方法

结果

1．人与小鼠海马组织基本信息

2．小RNA测序原始数据基本情况

3． 人与小鼠海马小RNA片段匹配情况及长度分布

4．miRNA表达谱质量

5．人与小鼠海马小RNA种类及丰度比较

6．新miRNA鉴定

7．人与小鼠海马组织富集表达的miRNA分布及功能

8．人与小鼠海马表达的miRNA家族比较

9．人与小鼠海马同源miRNA表达模式保守

10．人与小鼠海马差异表达的同源miRNA

11．人海马差异表达的miRNA-mRNA功能调控网络

讨论

总结

参考文献

第三部分 多巴胺D5受体与胃泌素受体相互作用及其促尿钠排泄效应研究

摘要

ABSTRACT

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方祛

结果

1．D5R与CCKBR在HK-2细胞中协同互作

2．HK-2细胞多巴胺受体功能正常

3．D5R与CCKBR在NT细胞中协同互作

4．D5R与CCKBR相互作用特异性验证

5．D5R与CCKBR直接或间接互作

6．CCKBR-/-小鼠血压

7．D5R与CCKBR在BALB/c小鼠肾脏互作

8．CCKBR-/-4小鼠的尿钠排泄情况

9．D5R与CCKBR互作和尿钠排泄

讨论

总结

参考文献

文献综述 microRNA在大脑进化及发育过程中的一般特征

缩略词汇

个人简历

致谢

声明