利用B细胞抗体类别转换模型进行A-EJ修复通路的研究

摘要

保持基因组的完整性和稳定性对于生物体的存活是至关重要的。DNA双链断裂(DSB)是所有DNA损伤中最为严重的一种，可以通过外界因素（如电离辐射和化学诱变剂）和内源因素（如内源性DNA氧化以及DNA复制压力）产生。哺乳动物体内的DSB修复方式主要有两种:依赖于同源序列的同源重组(HR)和不依赖于同源序列的非同源末端连接(NHEJ)。近几年的研究发现，在经典的非同源末端连接(C-NHEJ)缺失的情况下，DSB末端仍然可以被有效地修复，预示着非经典末端连接(A-EJ)修复通路的存在。A-EJ活性已经在多种系统中得到证实，特别是在C-NHEJ核心因子（如DNA连接酶Ⅳ）缺陷的B细胞中，A-EJ介导的垮H基因座位置的抗体类别转换(CSR)效率是野生型细胞的50％。
　　大量研究已经证实A-EJ的显著特点是对微同源序列(MH)的偏好性，以及在染色体转位过程中的重要作用。虽然目前已经有多个蛋白因子被报道参与A-EJ过程，但是其结果往往存在争议，特别是对参与A-EJ修复的DNA连接酶的研究还很不清楚。
　　本研究利用CRISPR/Cas9系统，在Lig4缺陷的小鼠B细胞系CH12F3中完全敲除Lig1或者细胞核内的Lig3，建立只含有单个DNA连接酶（分别为Lig3和Lig1）的CH12F3细胞系。令人惊讶的是，只含有Lig1或Lig3的CH12F3细胞仍然具有A-EJ活性，可以有效地催化IgH基因座的CSR过程以及同一条染色体上由CRISPR/Cas9产生的DSB之间的染色体缺失;并且其活性与Lig1/Lig3同时存在的细胞没有明显差别。然而，在催化染色体转位方面，含有Lig1和Lig3的复合物显示出不同的特性。完全敲除细胞核中的Lig3，Lig4-/-细胞的染色体转位明显减少，而在完全敲除Lig1的细胞中则没有这种变化。另外，染色体转位连接处微同源序列的分析揭示了不同DNA连接酶催化活性的特异性。这些数据表明存在多种含DNA连接酶的复合物用以催化A-EJ过程。
　　另外，本研究在小鼠B细胞中建立了CRISPR/Cas9高通量筛选方法，在野生型和Lig4缺陷的细胞中筛选参与CSR过程中DSB修复的基因。首先建立了Cas9稳定表达的CH12F3细胞系（野生型和Lig4缺陷型），并对sgRNA筛选的整个过程进行了优化。利用优化的实验条件，在Cas9稳定表达的WT和Lig4-/-CH12F3细胞中进行sgRNA文库的高通量筛选。对不同细胞群中的sgRNA进行高通量测序，通过MAGeCK分析方法，筛选IgA阳性细胞群中显著减少和IgA/IgM双阴性细胞群中显著增加的基因。在WT细胞中，筛选得到了DNA-PKcs和Lig4等核心C-NHEJ蛋白因子，以及一些已知的参与细胞因子介导的CSR过程的基因。对其它未知功能的候选基因进行检测，发现Brd9和Fbxo28缺失严重影响细胞因子介导的CSR。目前正在对这一结果进行进一步验证。同时，基于Cas9/sgRNA介导的CSR模型的高通量筛选也正在进行。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 DNA损伤修复的重要性

1．1．1 DNA损伤的发生

1．1．2 DNA损伤修复的重要性

1．2 DNA双链断裂修复方式：HR和C-NHEJ

1．2．1 HR修复机制

1．2．2 C-NHEJ修复机制

1．2．3 HR和C-NHEJ的细胞周期性调控

1．2．4 HR和C-NHEJ的协同及竞争作用

1．3．1 A-EJ修复方式的发现

1．3．3 A-EJ修复方式的常用研究模型

1．3．4 A-EJ修复方式的研究进展

1．3．5 A-EJ修复与端粒融合

1．3．6 A-EJ修复与染色体转位，以及癌症发生的关系

1．4 CRISPR／Cas9系统

1．4．1 CRISPR／Cas9系统的简介

1．4．2 利用CRISPR／Cas9系统进行基因编辑的研究

1．4．3 利用CRISPR／Cas9系统进行高通量筛选

1．5 本研究的内容及意义

1．5．2 全基因组筛选参与A-EJ修复通路的基因

1．5．3 研究意义

第2章 研究材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 cDNA与质粒

2．1．2 菌株

2．1．3 细胞系

2．1．4 分子克隆试剂

2．1．5 抗体

2．1．6 大肠杆菌培养试剂

2．1．7 Western免疫印迹试剂

2．1．8 细胞培养试剂

2．1．9 细胞转染及感染试剂

2．1．10 细胞基因组提取试剂

2．1．11 实时定量PCR(Real-time PCR或qPCR)试剂

2．1．12 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 DNA片段、质粒及基因组纯化方法

2．2．2 质粒载体构建

2．2．3 细胞培养，细胞转染以及慢病毒感染

2．2．4 Surveyor法检测sgRNA活性

2．2．5 Western免疫印迹

2．2．6 过表达及基因敲除细胞系的建立

2．2．7 CSR检测

2．2．8 细胞增殖及药物敏感性检测

2．2．9 实时定量PCR(Real-time PCR或qPCR)

2．2．10 染色体缺失效率检测

2．2．11 染色体转位检测

2．2．12 sgRNA高通量筛选

2．2．13 高通量测序文库的构建

第3章 研究结果

3．1 研究参与A-EJ修复通路的DNA连接酶

3．1．1 构建DNA Lig1或Lig3基因敲除的CH12F3细胞系

3．1．2 检测DNA Lig1或Lig3基因敲除细胞的CSR效率

3．1．3 检测DNA Lig1或Lig3基因敲除细胞的增殖及对药物的敏感性

3．1．5 检测DNA Lig1或Lig3基因敲除对染色体转位的影响

3．2 全基因组筛选参与A-EJ修复通路的基因

3．2．1 构建Cas9稳定表达的CH12F3细胞系

3．2．2 优化CRISPR／Cas9高通量筛选流程

3．2．3 在野生型CH12F3细胞中阳性对照的建立

3．2．4 高通量sgRNA文库筛选及其测序文库构建

3．2．5 高通量测序数据分析

3．2．6 候选基因验证

第4章 讨论

4．2 CRISPR／Cas9高通量筛选C-NHEJ和A-EJ通路的基因

参考文献

附录

致谢

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