胃癌变相关分子事件研究；SMC4在肺腺癌中的功能及相关分子机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述:
　　第一部分 胃癌变相关分子事件研究
　　第一章 胃癌前病变及胃癌全基因组表达谱研究
　　背景:胃癌变是一个多阶段、多因素、多基因参与的复杂过程。胃多阶段癌变模型认为正常胃粘膜进展为胃癌需要以下几个连续阶段:正常胃粘膜→非萎缩性胃炎→多灶萎缩性胃炎→肠化生→低级别上皮内瘤变→高级别上皮内瘤变→癌。利用表达谱芯片技术全面系统的对胃癌前病变及胃癌序列进行分子生物学研究，具有重要的临床和科研价值。
　　目的:本课题旨在研究胃癌变各阶段组织在分子表达谱水平上的相似性和差异性;筛选胃癌变过程中可能起关键作用的分子，挖掘胃癌早期诊断标志物。
　　方法:本部分研究收集了66对胃不同病变阶段新鲜组织，包括20例低级别上皮内瘤变、23例高级别上皮内瘤变、19例早期胃癌、4例进展期胃癌和配对的邻近染色正常组织，用于全基因组表达谱芯片的检测;收集了50例胃癌患者的福尔马林浸泡石蜡包埋组织样本，一张切片上同时包括正常组织、癌前病变组织和胃癌组织，利用免疫组织化学染色(immunochemistry，IHC)对表达谱芯片数据筛选出的分子进行验证。
　　结果:胃癌前病变及胃癌样本表达谱数据分析结果表明，在分子水平上胃癌前病变与胃癌具有相似性:很多肿瘤细胞的特征，例如DNA复制、细胞分裂、细胞周期等相关基因的上调以及生长负调控、支链氨基酸代谢等相关基因的下调，在癌前病变阶段已经显现;癌前病变组织和胃癌组织相对于邻近组织有着相似的差异表达模式，在胃癌组织中差异表达的基因绝大多在癌前病变阶段已经有了一致的差异表达。此外，胃癌前病变和胃癌在分子表达谱上存在差异性，主要涉及免疫反应和细胞粘附。一方面，我们发现562个基因可能参与了胃癌变过程，其中在蛋白互作网络中最为核心且紧密联系的8-基因模块为CD40LG、CTLA4、GZMB、ICAM1、ITGAX、SELL、TGFB1、TNF，这些分子参与了淋巴细胞和单核细胞的迁移、免疫负调控、细胞外基质组织等过程，与胃癌患者的总生存相关。另一方面，为了寻找胃癌早期诊断标志物，我们挑选了4个在胃癌变过程中表达水平持续升高的基因进行后续免疫组化验证，结果显示，在胃癌变过程中，CCL3和CD300A的蛋白表达量和阳性率持续升高;与邻近组织相比，OSM和CHI3L1在癌前病变组织和胃癌组织中的表达量和阳性率显著升高，然而OSM和CHI3L1在癌前病变组织和胃癌组织中的表达量和阳性率没有显著差异。受试者工作特征曲线分析结果表明这四个分子对胃癌早期诊断可能具有一定的临床价值。
　　结论:在分子水平上胃癌前病变与胃癌具有相似性，胃癌前病变可能是胃癌发生的基础。胃癌前病变和胃癌在分子表达谱上存在差异性，主要涉及免疫反应和细胞粘附，这些基因的变化可能与癌前病变向胃癌恶性转化密切相关。8-基因模块可能在胃癌变中发挥关键作用。CCL3，CD300A，CHI3L1和OSM是潜在的胃癌早期诊断标志物。以胃多阶段癌变模型作为理论基础，利用胃不同病变阶段样本对胃癌变过程进行研究，有助于阐明胃癌发生发展机制、寻找癌变关键分子和潜在的胃癌早期诊断标志物。
　　第二章 胃癌前病变及胃癌TCR免疫组库研究
　　背景:基于肿瘤浸润淋巴细胞的免疫治疗，主要依赖于抗原和T细胞受体(T-cellreceptor, TCR)的相互作用，已经在实体瘤的治疗中显现出潜在的临床应用价值。然而，TCR免疫组库的很多基本特征仍然不清楚;癌变过程中TCR免疫组库的变化，尤其是癌前病变阶段，目前还没有任何相关研究。
　　目的:本课题旨在探究胃癌变过程中组织浸润TCR免疫组库的特征以及病变组织分子表型与病变微环境TCR免疫组库的关系。
　　方法:研究纳入了41例不同病变阶段的胃组织样本，包括低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌和配对的邻近组织。我们通过多重PCR捕获建库和Ilumina Hiseq2000测序平台对TCRβ互补决定区3进行了深度测序。此外，为了研究病变组织分子表型与病变微环境TCR免疫组库的关系，我们对相应的胃癌前病变样本和早期胃癌样本进行了全基因组表达谱芯片检测。
　　结果:分析结果显示，T细胞克隆多样性和TCR免疫组库的频率分布在胃癌变过程中没有显著变化。然而，在胃癌变过程中，病变组织和配对邻近组织TCR免疫组库的相似性逐渐降低。病变组织和配对邻近组织之间的TCR免疫组库的重叠逐渐降低，为抗原驱动克隆扩增提供了直接的证据;越来越多的病变抗原相关T细胞克隆变成了高频克隆，而且它们占有的频率在胃癌变过程中逐渐增加。此外，病变组织和配对邻近组织之间的共有高频T细胞克隆的频率相似性在胃癌变不同阶段迅速降低。最后，利用基于网络的派系过滤方法对表达谱芯片数据和TCR免疫组库变异指数进行整合分析，我们找到了一个包含11个基因的模块，这11个基因的表达量与胃癌病人的总生存显著相关。
　　结论:我们的研究阐明了在胃癌变过程中组织浸润TCR免疫组库的多阶段异质性。突变细胞和免疫系统之间的相互作用可能在细胞恶性转化过程中发挥重要作用。本研究加深了我们对胃癌变过程中免疫反应的理解。
　　第二部分 SMC4在肺腺癌中的功能及相关分子机制研究
　　背景:越来越多的证据显示，胚胎发育和肿瘤形成在组织形态、细胞生物学学行为以及分子表达模式等方面具有极大的相似性。利用胚胎发育与肿瘤发生的相似性，重新审视正常发育的独特过程，深入挖掘胚胎发育过程中分子谱的变化规律，可以在最大程度上规避肿瘤异质性给研究带来的种种困难。染色体结构维持蛋白4(Structural maintenance of chromosome4，SMC4)是集缩素蛋白复合体(condensin)的核心蛋白，主要参与染色体的凝集和分离。实验室前期发表的人胚胎肺发育样本和肺腺癌样本mRNA表达谱数据分析结果显示，SMC4在胚胎肺发育过程中持续下调，在肺腺癌中却呈现高表达。
　　目的:本课题旨在探索从肺发育数据中挖掘的蛋白SMC4在肺腺癌发生发展中所发挥的功能及相关分子机制。
　　方法:首先，利用实时定量PCR(Real-time PCR)对43对手术切除的肺腺癌组织及其癌旁组织的SMC4 mRNA表达水平进行验证。接着，利用IHC对75例FFPE肺腺癌组织及其癌旁组织的SMC4蛋白表达水平进行了验证，并利用log-rank检验分析了SMC4表达量与肺腺癌病人生存的关系。利用CCK-8实验和transwell实验检测SMC4对肺腺癌细胞增殖和侵袭的影响。为了进一步探索SMC4在肺腺癌发生发展中的机制，我们通过免疫共沉淀联合质谱分析找到了SMC4潜在的相互作用蛋白DDX46(DEAD-box helicase46)。最后，利用免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验验证SMC4和DDX46的相互作用。
　　结果:Real-time PCR和IHC分别从RNA和蛋白水平上证实了SMC4在肺腺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，而且SMC4蛋白高表达是肺腺癌独立的预后不良因素（log-rank检验，p=0.036）。细胞实验表明，SMC4敲降显著抑制A549细胞的增殖和侵袭。此外，SMC4敲降后，与增殖相关的蛋白PLK1，Cyclin B1，CDK1表达量显著下调。对人胚胎肺发育样本和肺腺癌样本mRNA表达谱数据进行分析发现，SMC4和DDX46表达模式相似;Speraman相关性分析结果表明，SMC4和DDX46的mRNA表达水平显著正相关(r=0.629，p＜0.0001)。正反向Co-IP证实SMC4和DDX46存在相互作用。免疫荧光共定位实验发现，SMC4和DDX46在细胞周期的各个时相均存在共定位现象。
　　结论:SMC4在肺腺癌组织中的表达量显著高于癌旁肺组织，而且SMC4蛋白高表达是肺腺癌独立的预后不良因素。SMC4促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭。SMC4和DDX46存在相互作用，可能通过影响pre-mRNA剪切参与肺腺癌的发生。在发育过程中与SMC4有相似表达模式的基因，可能同时参与肿瘤的形成。通过胚胎发育相关分子事件对肿瘤发生进行比较学研究，是一种挖掘潜在的肿瘤标志物和治疗靶点的有效方法，也有助于阐明肿瘤的发生发展机制。

目录

图索引

表索引

英文缩略词

摘要

第一部分 胃癌变相关分子事件研究

前言

第一章 胃癌前病变及胃癌全基因组表达谱研究

材料与方法

结果

讨论

第二章 胃癌前病变及胃癌TCR免疫组库研究

材料和方法

结果

讨论

第二部分 SMC4在肺腺癌中的功能及相关分子机制研究

前言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．SMC4在肺腺癌组织中表达量显著高于相应癌旁组织

2．SMC4蛋白高表达是肺腺癌独立的预后不良因素

3．SMC4敲降显著抑制A549细胞的增殖和侵袭

4．SMC4和剪切体组分DDX46存在相互作用

讨论

参考文献

基金资助

已发表与学位论文相关的英文论文

文献综述 胃癌及癌前病变的研究进展

致谢

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