桑寄生顽拗性种子生物学特性及脱水敏感性机理研究

摘要

桑寄生是地位重要但不易繁育的特殊药材，其种子为典型的顽拗性种子，失活快，脱水敏感性强。而种子作为其唯一的繁殖材料，严重制约其繁育。目前顽拗性种子保存研究多，但成功实例较少，其根本原因是对脱水敏感性引起的死亡机理知之甚少，而种子脱水敏感性是引起顽拗性种子死亡的关键科学问题。
　　本研究从桑寄生种子生物学特性、脱水敏感性、低温保存等方面进行系统的研究，实现桑寄生种子繁育与保存的目标;围绕桑寄生种子脱水过程中细胞的形态结构及抗氧化系统进行综合研究，筛选脱水敏感性关键时期的种子进行高通量测序，挖掘与脱水敏感性相关的关键基因，从而揭示桑寄生顽拗性种子脱水敏感性的分子机理，不仅为研制桑寄生种子的繁育与保存关键技术提供理论依据，也为研究其它顽拗性种子提供新的知识与思路。其主要研究结果如下:
　　(1)影响检测桑寄生种子生活力的因素的主次为染色时间＞TTC浓度＞染色温度，最佳鉴定方法为沿种子长轴的两侧纵向切开成两半，在30℃下，将种子至于浓度为0.8％TTC的溶液中黑暗染色8小时。
　　(2)种子最佳发芽床是纸床;不同温度处理种子发芽率之间差异显著，最佳发芽温度是变温处理(25/30℃);光照对种子的萌发无影响;种子不用消毒，用灭菌水处理效果最好;不同批次的种子质量有差异，春季采收的种子发芽率最高。
　　(3)桑寄生种子是典型的顽拗性种子，对低温极其敏感，长期保存困难，自然状态下保存7天后就失去了活力。其最佳的保存方法是:将用无菌水处理过的新鲜种子浸泡到2mg/L的ABA溶液中30min，取出放置于铺有2层滤纸的培养皿内，然后用封口袋包装好置于4℃的冰箱，120天后种子仍有活力。
　　(4)根据桑寄生种子的萌发特性，将桑寄生种子的质量分为三级，要求纯度和净度都为100％。一级发芽率不低于75.0％，水分不低于50.0％，百粒重不低于60.0g;二级发芽率不低于70.0％，水分不低于40％，百粒重不低于50.0g;三级发芽率不低于60.0％，水分小于40.0％，百粒重低于50.0g。
　　(5)桑寄生最佳的繁殖方法为采集新鲜、饱满、无病虫害的果实去掉果皮，粘于2年生桑树上部直径大于1.0cm的枝条之上，早晚洒水，使桑林间空气湿度保持在80％以上。
　　(6)桑寄生种子对脱水非常敏感，其活力和发芽率与含水量显著相关。新鲜种子的发芽率为86％（活力为99％），脱水16h后发芽率迅速下降到39％(活力为66％，含水量为35.17％)，36h后含水量会下降至24.93％，种子活力变为15％，而发芽率仅为6％，40h种子含水量为23.47％时，种子基本丧失了活力，只有9％，而发芽率为0。
　　(7)桑寄生种子脱水过程中细胞显微和超微结构变化很大。显微观察显示脱水过程中细胞间隙逐步增大，细胞质和细胞壁逐渐分离，从而导致细胞进一步降解;超微结构显示脱水过程中各种细胞器受到不同程度的损伤，线粒体结构破裂，核膜变得模糊不清，核仁逐步降解，淀粉粒和脂肪体进一步分解劣变;脱水过程中生理指标变化较大，随着脱水处理时间的增加，内源激素ABA、ZR、GA、IAA含量总体上呈现先上升再下降的变化趋势，种子内的SOD活性呈总体下降趋势，超氧阴离子自由基含量、可溶性蛋白和MDA含量则随种子含水量下降而增加。
　　(8)对不同部位桑寄生总RNA提取方法研究表明，CTAB-LiCl法提取效果最好，TriZol试剂盒法和改良TriZol法均不能有效的去除桑寄生中的多糖和蛋白质等杂质。
　　(9)利用高通量测序技术，对未脱水的桑寄生种子(CK)，脱水16小时(Tac-16)和脱水36小时(Tac-36)进行了转录组分析，一共得到386，542，846条高质量序列。利用Trinity软件，组装得到164，546转录本（对应114，971基因）。通过与NR，UniProt，GO，KEGG pathway和COG数据库进行比对，并对组装得到的转录本进行了详细的注释。在CK，Tac16和Tac-36样本中，分别检测到60，695，56，027和66，389转录本(＞1FPKM)。通过与CK进行比较，在Tac-16中发现了2，102个上调和1，344个下调的转录本，而在Tac-36中发现了1，649个上调和2，135个下调的转录本。这些差异表达的转录本包含一些与已知的脱水过程相关的基因，比如RD22，热休克蛋白(HSP)，转录因子（MYB，WRKY和乙烯反应性转录因子）。研究结果显示HSP和核糖体蛋白(ribosomal proteins)属于桑寄生顽拗性种子早期响应脱水过程的重要基因。原始数据已提交到NCBI SRA数据库(SRA309567)。
　　本研究系统地对桑寄生种子的生物学特性进行研究，也是第一次利用转录组技术研究桑寄生顽拗性种子脱水敏感性的机理，所得结果对于桑寄生种子的繁育、保存及脱水过程中的基因调控具有重要的指导意义，并拓宽了对于顽拗性种子脱水及萌发过程中基因变化的认识。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

第一节 桑寄生研究进展

1 桑寄生资源研究

2 桑寄生化学及药理研究

3 临床应用

4 桑寄生的繁殖与栽培技术研究

5 展望

第二节 植物顽拗性种子研究进展

1 顽拗性种子易失活的特性及脱水敏感性

2 顽拗性种子易失活的脱水敏感性生理生化研究

3 展望

第三节 种子发育转录组研究进展

2 种子发育转录组研究的特点和内容

3 种子发育转录组研究

参考文献

第二章 桑寄生种子生物学特性及质量标准研究

第一节 桑寄生种子生活力研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第二节 不同因素对桑寄生种子萌发的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第三节 桑寄生种子保存技术研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第四节 种子质量标准研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第五节 桑寄生种子繁殖技术研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 桑寄生顽拗性种子脱水敏感性机理研究

第一节 桑寄生种子脱水敏感性研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第二节 种子脱水过程中细胞结构及生理变化研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第三节 不同部位RNA提取方法研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第四节 种子脱水过程中转录组学研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

致谢

个人简历