食管癌外泌体介导的恶性表型研究及肿瘤转移相关基因1(MTA1)相关外泌体的定量蛋白质组学分析

摘要

目的:探讨食管癌外泌体介导的肿瘤细胞之间的恶性表型传递以及MTA1对食管癌细胞外泌体特性及蛋白成分影响。
　　方法:采用差速超速离心法提取KYSE410细胞外泌体，通过透射电镜及免疫印迹法(Western blotting)观察所获得的外泌体的形态及其标志物;共聚焦显微镜观察KYSE410、KYSE510和YES2细胞摄取荧光染料标记的KYSE410外泌体;分别采用transwell实验、划痕愈合实验、细胞增殖实验、克隆形成实验检验KYSE410细胞外泌体对3种食管癌细胞迁移、侵袭、增殖和克隆形成的影响;免疫印迹法检测Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路相关蛋白的变化。分别对MTA1共表达基因和MTA1 Co-IP质谱相互作用蛋白作聚类分析;Nanosight检测不同MTA1表达水平的食管癌细胞分泌的外泌体粒径大小;Label-free质谱方法检测不同MTA1表达水平的食管癌细胞的外泌体蛋白并对差异蛋白作GO功能聚类分析;通过CCLE数据库和cBioPortal平台数据分析MTA1和目标差异蛋白在组织、细胞水平的相关性;分析目标差异蛋白与临床病理特征的相关性。
　　结果:透射电镜可以观察到具有膜结构的外泌体;免疫印迹方法能够检测到外泌体标志蛋白CD63和CD81;3种细胞均能够成功摄取荧光染料标记的KYSE410外泌体;3种食管癌细胞的迁移及侵袭能力从大到小依次为KYS E410、KYSE510、YES2，KYSE410外泌体能够促进3种食管癌细胞迁移、侵袭及克隆形成，但不影响3种食管癌细胞的增殖;外泌体处理能够增强3种食管癌细胞中β-catenin和p-Akt的表达。MTA1共表达基因聚类分析显示MTA1影响囊泡组织与生物合成;MTA1 Co-IP质谱相互作用蛋白聚类分析显示绝大多数MTA1相互作用蛋白在外泌体中有定位;不同MTA1表达水平的KYS E410细胞和KYSE450细胞分泌的外泌体的大小和数量没有显著差异;首次鉴定出25个新的外泌体蛋白成分;CytoScape软件分析两组外泌体蛋白连接度最高的节点均在UBC蛋白;对照/敲除MTA1的KYSE410细胞获得外泌体蛋白和对照/过表达KYSE450细胞获得的外泌体蛋白都主要定位在胞浆、细胞核、溶酶体、质膜等部位，主要的分子功能包括催化活性、分子伴侣活性、细胞骨架蛋白结合、GTPase活性等，主要影响的生物学进程包括蛋白代谢、能量通路、细胞生长和维持、免疫反应等;广泛参与整联蛋白家族细胞表面相互作用、β1整联蛋白细胞表面相互作用、蛋白多糖syndecan介导的信号事件等;对照/敲除MTA1的KYSE410细胞和对照/过表达KYSE450细胞的外泌体内MTA1调控的差异蛋白共同参与大分子代谢负调控、磷酸盐代谢、大分子分解代谢等生物学进程;MYH9、SLC7A5和CCT4均与MTA1在组织水平有中等强度相关性;MYH9、CCT4和食管癌病人T分期、临床分期有相关性;SLC7A5、CCT4高表达的食管癌病人总生存时间更短。
　　结论:高侵袭性食管癌细胞KYSE410来源的外泌体能够促进自身以及食管癌KYSE510、YES2细胞的迁移和侵袭、克隆形成，其可能是通过激活Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路发挥上述作用的。聚类分析结果表明MTA1可能参与外泌体调控;MTA1不影响食管癌细胞分泌外泌体的大小和总量;但MTA1影响食管癌细胞外泌体的蛋白质组成;关键的差异蛋白MYH9、SLC7A5、CCT4可能作为食管癌的预后评价指标。

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