第一部分：HECTD3预测及调控晚期卵巢浆液性腺癌铂类化疗敏感性的机制研究；第二部分：保留盆腔自主神经的宫颈癌根治术应用于局部晚期宫颈癌的临床研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述:
　　第一部分 HECTD3预测及调控晚期卵巢浆液性腺癌铂类化疗敏感性的机制研究
　　目的:以卡铂为基础的联合化疗在卵巢癌治疗中占有重要地位，而铂类耐药是导致卵巢癌预后不良的主要因素，寻找预测以及逆转铂类耐药的分子靶点意义重大。前期研究中发现新型E3泛素连接酶HECTD3可保护细胞避免凋亡，并且在乳腺癌和宫颈癌中与铂类耐药相关。本文将对HECTD3在卵巢癌中的表达及参与铂类耐药的调控机制进行研究。
　　方法:研究分四步进行，采用的实验方法包括，1）收集2007年5月至2013年1月我院初治的晚期卵巢浆液性腺癌150例纳入回顾性研究，手术标本制作成组织芯片。通过免疫组化染色(IHC)评价卵巢癌组织中HECTD3表达与其他临床-病理因素的相关性;通过随访进行生存统计，并采用Kaplan-Meier法进行生存分析，Log-rank检验进行预后单因素分析，Cox回归模型行进行预后多因素分析。2）采用蛋白印迹法(WB)对比SKOV3及顺铂诱导的耐药细胞系SKOV3R(DDP)中HECTD3的表达差异。通过流式检测上述两种细胞系对卡铂诱导的凋亡差异。构建HECTD3敲降的稳转SKOV3R及对照细胞系，应用AnnexinⅤ/PI双染法通过流式细胞术检测敲降株与对照株对卡铂诱导细胞凋亡的差异。用上述细胞系构建小鼠皮下荷瘤模型，给予卡铂治疗，对比肿瘤的抑制效果。3）选用Her2抑制剂（Lapatinib，Neratinib和Herceptin）分别处理SKOV3、SKOV3R和A2780细胞系，WB检测HECTD3和pSTAT3的表达情况。随后，应用siRNA在SKOV3和A2780细胞中瞬时敲降Her2，并通过WB检测Her2、HECTD3和pSTAT3的表达情况。进一步在组织水平通过IHC分析HECTD3与Her2的表达相关性。此外，在SKOV3细胞系中分别敲降STAT3及过表达STAT3，并通过WB检测pSTAT3和HECTD3的表达情况。后通过双荧光素酶报告基因检测法定位STAT3影响HECTD3启动子活性的序列。4）选用SKOV3细胞分别给予卡铂单药、拉帕替尼单药及联合药物处理，通过流式细胞术检测细胞凋亡差异;进而用SKOV3细胞系构建小鼠皮下荷瘤模型，给予同上分组药物处理，治疗结束后剖取肿瘤大小对比拉帕替尼与卡铂联合与任一单药的抑制效果差异。
　　结果:本研究发现，1）卵巢浆液性腺癌组织芯片IHC评分与临床病理资料分析结果显示铂敏感或铂耐药复发与HECTD3的表达水平密切相关(P＜0.01)。在卵巢浆液性腺癌中HECTD3表达高，预后差。多因素分析结果显示HECTD3的表达水平(P＜0.05)、FIGO分期(P＜0.05)和残存肿瘤大小(P＜0.05)是PFS的独立预后影响因素;仅HECTD3的表达水平(P＜0.05)是OS的独立影响因素。2）在细胞水平研究发现，SKOV3R细胞系中HECTD3的表达显著高于其亲本SKOV3细胞系，且SKOV3R较SKOV3对卡铂具有耐药性。体外研究结果显示，敲降HECTD3可提高SKOV3R对卡铂诱导的细胞凋亡;在体内研究中同样观察到HECTD3表达降低可一定程度逆转SKOV3R对卡铂的敏感性。3）耐药机制研究发现，Her2-STAT3信号通路参与调控HECTD3的表达，WB检测发现抑制Her2可协同降低pSTAT3和HECTD3的表达水平。并证实STAT3可调节HECTD3的转录活性。此外，在组织水平通过IHC验证Her2与HECTD3表达呈正相关（spearman相关系数为0.214，P=0.007）。4）拉帕替尼联合高/低浓度的卡铂较卡铂单药在体外可显著促进卵巢癌细胞的凋亡(A2780: CBP-HP=0.047; SKOV3: CBP-L P=0.045，CBP-H P=0.032)。拉帕替尼联合卡铂较任一单药在体内亦可显著抑制卵巢癌肿瘤生长(CBP+L vs CBP P＜0.0001, CBP+L vs L P=0.0001)。
　　结论:综上所述，HECTD3的表达与铂类耐药呈现正相关，是影响卵巢浆液性腺癌预后的独立因素。降低HECTD3表达可提高卵巢癌对铂类药物的敏感性。此外，HECTD3可通过STAT3接受Her2的正向调控，且在组织水平HECTD3与Her2表达呈正相关。Her2抑制剂可通过这一通路为铂类治疗增敏。因此，HECTD3具有作为卵巢浆液性腺癌分子标志物及治疗靶点的潜质。
　　第二部分 保留盆腔自主神经的宫颈癌根治术应用于局部晚期宫颈癌的临床研究
　　目的:评价Q-M分型体系中保留盆腔自主神经的宫颈癌根治术(Nerve sparing radicalhysterectomy, NSRH)在局部晚期宫颈癌治疗中的安全性及对预后的影响。
　　方法:采用回顾性队列研究方法收集2008年1月至2014年12月于中国医学科学院肿瘤医院接受开腹NSRH（69例）和开腹传统宫颈癌根治术（RH，320例）的局部晚期（Ⅰb2和Ⅱa2期）宫颈癌患者的临床病理资料及手术参数，中位随访67个月，评价预后及术后膀胱功能恢复情况。
　　结果:两组病例基本参数匹配，(1)多因素预后分析结果显示盆腔淋巴结转移是影响局部晚期宫颈癌患者DFS（HR=1.31，95％CI为1.01～1.68，P=0.040）和OS(HR=1.30，95％CI为1.01～1.67，P=0.046)的独立预后危险因素。(2)手术保留盆腔自主神经与否对局部晚期宫颈癌的无疾病进展生存(P=0.746)和总生存(P=0.910)均没有影响;(3)对比RH组，NSRH组手术时间虽明显延长(262±51min vs.245±52min，P＜0.01)，但出血量少（366±302mlvs.457±301ml，P＜0.05），术后导尿时间短（11.0±8.9天vs.15.5±6.6天，P＜0.01），以及远期膀胱功能异常比例低(6.1％ vs.16.0％，P＜0.05)。
　　结论:保留盆腔自主神经的宫颈癌根治术可用于局部晚期宫颈癌的治疗，预后同传统宫颈癌根治术相仿，且NSRH可提高手术质量并显著改善患者近期及远期膀胱功能。

目录

中英文缩略词

第一部分 HECTD3预测及调控晚期卵巢浆液性腺癌铂类化疗敏感性的机制研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 保留盆腔自主神经的宫颈癌根治术应用于局部晚期宫颈癌的临床研究

摘要

前言

研究方法

结果

讨论

结论

参考文献

附表

泛素化修饰在卵巢癌中的研究进展(文献综述)

致谢

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