云南地区类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮与HLA-DRB1氨基酸单倍型的关联研究

摘要

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是常见的两种自身免疫疾病，发病机制目前还尚未清楚，普遍认为是由遗传因素和环境因素共同作用引起的。越来越多的研究证实了HLA-DRB1基因和RA、SLE疾病的易感性相关，但其相关的机制目前还尚未完全明白。HLA-DRB1基因属于HLAⅡ类基因，编码HLAⅡ类抗原的β链，参与抗原提呈过程。近期的研究表明，RA、SLE的易感性与HLA-DRB1基因抗原结合凹槽处的氨基酸类型及单倍型密切相关，推测可能是由于抗原结合凹槽处氨基酸的改变会影响HLA-DRB1分子的空间构象，从而影响HLAⅡ类分子对抗原肽的结合。但由于在不同种群中HLA-DRB1基因与RA、SLE相关的易感基因不一致。因此，HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型与RA、SLE的发病相关需要进一步的验证。随着全基因组关联研究（genome wide association study，GWAS）的开展，RA易感基因和SLE易感基因位点不断被发现，且通过对RA、SLE的GWAS研究结果比较发现，RA发病相关的重要基因对SLE的发生发展也很重要，这提示自身免疫性疾病可能有相似的遗传易感性。
　　为了探究云南地区汉族人群中RA、SLE的易患性与HLA-DRB1氨基酸类型及氨基酸单倍型的关联性，以及HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型对RA、SLE的发病相关是否存在相似的遗传机制。应用直接测序法(Polymerase chain resction-Sequence based typing，PCR-SBT)法对云南地区256例RA患者及例218例健康对照者、335例SLE患者及255例健康对照者的HLA-DRB1基因Exon2进行扩增并多次测序。根据测序结果获得HLA-DRB1基因位于抗原结合凹槽的第11、13、26、57、67、71、74位氨基酸的碱基数据，对照密码子表获得氨基酸残基类型及氨基酸单倍型。通过病例-对照研究进行HLA-DRB1氨基酸类型及其氨基酸单倍型与RA、SLE发病的关联研究。通过比较RA、SLE易患性与HLA-DRB1氨基酸类型及其氨基酸单倍型关联研究的结果，了解HLA-DRB1氨基酸类型及其氨基酸单倍型与RA、SLE发病相关的共性和个性。
　　结果:(1)云南地区人群中HLA-DRB1基因的11-V、11-L、13-H、13-F、57-S、67-L与RA的易感性相关。11-S、13-S、71-E、74-R可能起保护作用。而HLA-DRB1基因的第26位氨基酸与RA的易感性无关。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-13-26)LFL、VHF与RA的易感性相关。SSF、SSY可能起保护作用。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-71-74)LRA、VRA为RA患病的危险因素。SEA、SKR、SRA、SRE可能起保护作用。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-13-57-67-71-74)单倍型LFDLRA、VHSLRA为RA发病的危险因素。SSDFRA、SSDIEA、SSDLKR可能起保护作用。(2)云南地区人群中HLA-DRB1氨基酸的11-P、13-R、26-Y、71-A、74-L与SLE的易感性相关。11-V、13-H、13-S、26-L、71-R、71-E、74-A可能起保护作用。而HLA-DRB1基因的第57、67位氨基酸与SLE的易感性无关。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-13-26)PRF、SGF与SLE的易感性相关。SGL、SSF、VHF可能起保护作用。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-71-74)PAA为SLE发病的危险因素。SEA、SRA、VRA、VRE、DAE、GAQ、SAA、SAL可能起保护作用。HLA-DRB1氨基酸单倍型(11-13-57-67-71-74)SGSIRL为SLE患病的危险因素。VHDLRE、SSDIEA、SGVFRA、SGSIAL可能起保护作用。(3)RA、SLE的易感性都与HLA-DRB1的第11、13、71、74位氨基酸类型相关。13-S、71-E、SSF(11-13-26)、SEA(11-71-74)、SRA(11-71-74)对RA、SLE起保护作用。但是11-V、71-R、VHF(11-13-26)、VRA(11-71-74)可能是RA的风险因素，而对SLE可能起保护作用。且第26位氨基酸与SLE的易感性相关，但与RA无关;第57、67位氨基酸与RA的易感性相关，然而与SLE无关。与RA、SLE易感性相关的HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型完全不同。(4)用SNPs结合ELB算法推算HLA-DRB1基因单个位点氨基酸类型的准确率为100％，三个位点氨基酸单倍型的准确率为96.5％，六个位点氨基酸单倍型的准确率为93.7％。
　　结论:(1)在云南地区，HLA-DRB1氨基酸类型及氨基酸单倍型与RA、SLE的易患性相关。(2)与RA、SLE易感性相关的HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型完全不同，而对RA、SLE起保护作用的HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型有部分重叠，提示HLA-DRB1基因与RA、SLE的发病相关可能具有相同或相似的机制。其机制可能是抗原结合凹槽处特定的氨基酸类型及单倍型能与其致病抗原肽结合，提呈给CD4+T细胞激活免疫反应。(3)应用人群中HLA-DRB1的SNPs结合ELB算法可获得HLA-DRB1的氨基酸类型及氨基酸单倍型，其准确率与包含的氨基酸位点数相关。该方法具有准确性高和简便、快速的优点。

目录

摘要

前言

一．实验材料

1．1 研究对象

1．2 主要试剂及耗材

1．3 主要仪器设备

二．实验方法

2．1 DNA提取

2．2 DNA的定量

2．3 HLA-DRB1基因Exon 2扩增

2．4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

2．5 PCR产物切胶纯化

2．6 PCR纯化后产物测序

2．7 HLA-DRB1基因SNPs分型数据分析和统计

三．结果与分析

3．2 HLA-DRB1基因测序结果

3．3 HLA-DRB1基因Exon2的SNPs结果

3．4 HLA-DRB1基因的分型结果

3．5 HLA-DRB1氨基酸类型及氨基酸单倍型

3．6 HLA-DRB1氨基酸类型及氨基酸单倍型与RA易感性的关联研究

3．7 HLA-DRB1氨基酸类型及氨基酸单倍型与SLE易感性的关联研究

3．8 HLA-DRB1氨基酸类型及单倍型与RA、SLE的易感性是否存在共性或个性

3．9 HLA-DRB1氨基酸单倍型的多次测序结果与SNPs结合ELB算法推算结果比对

四．讨论

4．1 HLA-DRB1基因与RA的相关性

4．2 HLA-DRB1基因与SLE的相关性

4．3 HLA-DRB1与自身免疫疾病的易感性

4．4 关于方法学的讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢

研究生简历

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