帕金森氏病动物模型的建立和FLZ抑制神经炎症机制的研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 脂多糖加重α-synuclein基因突变小鼠多巴胺能神经元损伤机制的研究。
　　帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)是由遗传和炎症等多种病因引起的神经退行性疾病。有多种可模拟PD发病的动物模型，α-synuclein(A53T)转基因小鼠和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射小鼠分别从基因突变和炎症角度模拟PD的病理改变，但这些模型仅模拟PD发病的单一因素，且出现病理改变的时间较长。本实验采用LPS注射α-synuclein转基因小鼠建立炎症和遗传因素双重打击的PD模型。结果显示LPS联合α-synuclein转基因刺激可导致小鼠转棍和爬杆运动协调功能障碍，黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量明显降低，中脑TH的表达明显下降，纹状体中多巴胺含量显著降低，出现多巴胺能神经元功能低下的表现，以上行为学和病理改变均较二者单独刺激明显加重，表明联合刺激可加重模型损伤，表现出协同效应。机制研究发现LPS联合α-synuclein可引起明显的神经炎症和神经元凋亡，表现为小胶质细胞活化标志物Iba1表达增加以及与凋亡相关的Bcl2/Bax比值下降，细胞凋亡执行的关键分子caspase-3活性升高。差异蛋白质组学研究发现LPS和α-synuclein双重打击可导致小鼠脑中与炎症和凋亡相关蛋白CD99抗原样蛋白2(CD99L2)和细胞色素c氧化酶7A相关蛋白(COX7RP)的表达明显增加，提示这两种蛋白可能参与PD的发病过程，它们在PD发病中的作用机制有待于进一步研究探讨。以上研究表明在基因突变基础上引入炎症刺激可建立更理想的PD动物模型。
　　第二部分 FLz通过Src/PTEN/Akt信号通路抑制神经炎症的机制研究。
　　帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)的发病与神经炎症密切相关，小胶质细胞过度激活后可释放细胞因子、化学因子和兴奋性氨基酸等损伤周围神经元，导致神经元死亡和丢失。研究发现抑制小胶质细胞过度活化引起的神经炎症对PD有改善作用，因此抑制神经炎症可能是治疗PD的新策略。FLZ是番荔枝酰胺衍生物，临床前研究表明FLZ具有治疗PD的作用，现已进入Ⅰ期临床研究。FLZ治疗PD的作用与其抑制神经炎症而保护多巴胺能神经元有关，但具体抗炎机制尚不不十分明确。因此，本研究采用LPS诱发的小胶质细胞神经炎症模型探讨FLZ抑制神经炎症的相关机制。结果显示在LPS刺激的BV2细胞中，FLZ可明显降低PTEN和Akt的磷酸化水平，PTEN的低磷酸化状态促使其由胞浆向胞膜转位，从而提高PTEN磷脂酶活性，促进PIP3分解为PIP2，导致Akt活性下降。当用VOOH(pic)抑制PTEN活性后，FLZ对TNF-α的释放量与LPS+VOOH(pic)组相比无明显降低，表明PTEN可能在FLZ抑制炎症中起着重要的作用。研究发现Src酪氨酸激酶是炎症的重要调控蛋白，可调控PTEN的活性。本研究发现FLZ可明显抑制Src和PTEN的相互作用。当抑制Src后FLZ对PTEN的磷酸化水平无明显影响，过表达Src后FLZ可明显降低PTEN磷酸化水平，而抑制PTEN后FLZ仍可明显降低Src磷酸化水平，表明Src在FLZ抗炎效应中发挥重要作用，可能是PTEN的上游调控蛋白。进一步研究发现与LPS组相比，沉默Src后FLZ对Akt的磷酸化、TNF-α的释放以及iNOS和COX-2的表达均无明显影响，而过表达Src后与LPS组相比FLZ可显著降低Akt的磷酸化、TNF-α的释放以及iNOS和COX-2的表达，表明Src在FLZ抑制神经炎症中起着重要作用。进一步的分子对接研究表明，FLZ与Src之间存在相互作用，FLZ自身的H、O原子和苯环可与位于Src N-端的Glu280和C-端的Ala293侧链之间形成的活性口袋相结合。以上结果表明Src酪氨酸激酶可能是FLZ抑制神经炎症的重要分子靶点，FLZ通过抑制Src/PTEN/Akt信号通路而实现其抑制神经炎症作用，这为FLZ临床治疗PD提供理论依据。

目录

英文缩略词表(Abbreviations)

摘要

第一部分：脂多糖加重α-synuclein基因突变小鼠多巴胺能神经元损伤机制的研究

前言

材料与方法

实验结果

2．LPS加重α-Syn转基因小鼠多巴胺能神经元功能障碍

3．LPS促进α-Syn转基因小鼠神经炎症反应

4．LPS促进α-Syn转基因小鼠脑内神经元凋亡

5．蛋白质组学研究

6．差异蛋白的验证

小结

讨论

参考文献

第二部分：FLZ通过Src／PTEN／Akt信号通路抑制神经炎症的机制研究

前言

材料与方法

1．FLZ对PTEN和Akt磷酸化的影响

2．FLZ促进PTEN由胞浆向胞膜转位

3．FLZ提高PTEN磷脂酶活性

4．VOOH(pic)抑制PTEN剂量的筛选

5．PTEN在FLZ抑制神经炎症中的作用

6．FLZ降低Src酪氨酸激酶与PTEN磷脂酶间的相互作用

7．沉默和过表达Src酪氨酸激酶

8．FLZ通过Src酪氨酸激酶调控PTEN磷脂酶的活性

9．Src酪氨酸激酶在FLZ抑制Akt活性中的作用

10．Src酪氨酸激酶在FLZ抑制神经炎症中的作用

11．FLZ与Src酪氨酸激酶分子对接模拟

12．FLZ抑制神经炎症作用机制总结

小结

讨论

参考文献

个人简历

文献综述 NADPH氧化酶在帕金森氏病中的作用

致谢

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