一种IgM单克隆抗体快速高效制备平台的建立

摘要

单克隆抗体由于其特异性及高亲和力被广泛应用于基础研究、临床诊断及治疗。目前单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤技术，噬菌体等展示技术以及B细胞筛选等，而这些技术具有周期长，费时费力，操作复杂，费用高等缺点。
　　本研究拟利用鸡B淋巴瘤细胞(DT40)建立一种快速高效的单克隆抗体制备系统。DT40细胞免疫球蛋白可变区基因(IgV)持续发生高频基因转换及点突变，使其本身形成一个天然的抗体库，受AID基因调控，在获得分泌特异抗体的细胞后需关闭AID表达以免已获得的特异性抗体继续发生突变。为此，本研究的关键为构建一个AID可调控表达的DT40细胞系。首先，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除DT40细胞中AID基因。在遗传学水平上通过基因测序验证AID基因被敲除;在蛋白水平上，通过Western-blotting检测AID蛋白不表达;进一步通过免疫球蛋白可变区基因测序，在功能学水平验证AID在细胞中功能的缺失。随后，在AID基因缺失细胞株中稳定表达可调控的AID基因，并通过Western-blotting验证AID蛋白表达并通过IgV区基因测序验证AID诱导IgV基因突变，从而实现DT40细胞中AID基因的可调控表达。最后，利用磁珠偶联的寨卡病毒NS1蛋白对该细胞进行筛选从而获得分泌抗NS1抗体的DT40细胞克隆，通过ELISA筛选和验证抗体的亲和力以及特异性。该单克隆抗体制备系统的建立弥补了传统技术周期长、费用高的缺点，实现了单克隆抗体的快速制备，还可实现抗体亲和力成熟，在基础研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。

目录

声明

摘要

前言

实验材料与方法

实验材料

实验方法

实验结果

一、成功构建AID knock-out DT40细胞系

二、成功构建AID可调控表达DT40细胞系

三、利用25-AID细胞筛选寨卡病毒NS1抗体

讨论

综述 单克隆抗体制备方法的研究进展

参考文献

缩略语和部分专有名词

致谢

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