苯甲酸胁迫下人参基因差异表达分析及响应基因WRKY7的克隆与转化

摘要

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科多年生草本植物，是我国传统名贵中药材。其连作障碍问题十分突出，使人参不论从表观品质还是内在品质上都显著下降，严重时甚至造成绝收。化感自毒物质会导致土壤微生物种群结构、理化性状变化，被认为是引起连作障碍的主要原因之一。目前针对在自毒物质胁迫下人参基因差异表达的研究较少。本课题在前期转录组测序分析化感自毒物质苯甲酸胁迫下人参基因差异表达的基础上，根据测序结果结合功能注释信息分析了人参生理指标相关基因和转录因子基因的表达情况，从中挑选出1个WRKY转录因子基因克隆全长，对该基因进行深入的生物信息学分析并将其转入到模式植物拟南芥中，为进一步研究人参响应化感自毒物质胁迫的分子机制奠定了基础。主要成果如下：
　　(1)用实时荧光定量PCR的方法研究了苯甲酸胁迫下人参生理指标相关基因的差异表达情况，共7个基因。经分析发现，其中1个脯氨酸相关基因P5CS、1个丙二醛相关基因APX、2个活性氧(ROS)相关基因及2个过氧化物酶(POD)基因在苯甲酸胁迫后显著上调表达。
　　(2)研究了苯甲酸胁迫下人参转录因子基因的差异表达情况，共13个基因。经分析发现，其中8个WRKY基因、3个MYB基因及1个AP2/ERF基因在苯甲酸胁迫后显著上调表达;1个MYB基因下调表达。
　　(3)根据苯甲酸胁迫下的人参转录组数据，设计全长扩增引物，利用RT-PCR法获得1条编码WRKY转录因子的基因，命名为WRKY7(GenBank登录号：KX255632)，并对其进行TA克隆、测序和生物信息学分析。发现该基因cDNA全长1216bp，其开放阅读框(ORF)为1014bp，编码337个氨基酸，有1个WRKY结构域，其锌指结构为C2HC型，属于WRKY转录因子家族第Ⅲ类成员。经核苷酸水平同源性分析表明，该基因与西洋参的WRKY6(JF927162.1)、WRKY9(JF927165.1)亲缘关系最近，同源性均为87％。
　　(4)构建了pCAMBIA2300-WRKY7过表达载体，将其转入到农杆菌GV3101中，通过菌落PCR鉴定阳性克隆。采用浸花法将目的基因转入到哥伦比亚型拟南芥中，通过MS-Kan+培养基筛选获得转基因株系，经过三代筛选获得转基因纯系，为后续进行功能研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1．人参连作障碍

1．1 人参连作障碍的危害

1．2 人参连作障碍的原因

2．人参的化感自毒作用

2．1 人参化感自毒物质的种类

2．2 化感自毒物质的作用机制

2．3 化感自毒作用与基因表达调控

3．WRKY转录因子的研究进展

3．1 WRKY转录因子的结构

3．2 WRKY转录因子的功能

3．3 人参WRKY转录因子的研究概况

4．本章小结

第二章 苯甲酸胁迫下人参生理生化指标相关基因的差异表达分析

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 人参的胁迫处理与总RNA的提取

1．3 人参转录组测序数据的获得

1．4 qRT-PCR差异表达分析

2．结果与分析

2．1 RNA的提取及浓度的测定

2．2 转录组数据组装结果

2．3 差异表达分析结果

3．本章小结

第三章 苯甲酸胁迫下人参转录因子相关基因的差异表达分析

1．材料与方法

2．结果与分析

3．本章小结

第四章 人参中响应苯甲酸胁迫基因WRKY7的克隆及序列分析

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 RNA提取和cDNA合成

1．3 WRKY7基因的扩增与克隆

1．4 WRKY7基因的生物信息学分析

2．结果与分析

2．1 人参WRKY7基因的克隆

2．2 人参WRKY7基因编码氨基酸序列分析

2．3 人参WRKY7编码蛋白理化性质分析

2．4 人参WRKY7编码蛋白二级结构及功能结构域分析

2．5 人参WRKY7编码蛋白三维建模

2．6 人参WRKY7编码蛋白信号肽、亚细胞定位及跨膜分析

2．7 人参WRKY7基因序列相似性分析

2．8 人参WRKY7编码蛋白多序列比对及系统进化树构建

3．本章小结

第五章 人参WRKY7对拟南芥的遗传转化及纯系植株的筛选

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 预实验——苯甲酸对拟南芥、烟草发芽率的影响

1．3 植物过表达载体pCAMBIA2300-WRKY7的构建

1．4 农杆菌感受态的制备

1．5 过表达载体pCAMBIA2300-WRKY7转化农杆菌

1．6 农杆菌浸花法转化拟南芥

1．7 转基因植株的鉴定及纯系的构建

2．结果与分析

2．1 苯甲酸对拟南芥、烟草发芽率的影响

2．2 过表达载体pCAMBIA2300-WRKY7的构建

2．3 过表达载体pCAMBIA2300-WRKY7转化农杆菌

2．4 转基因拟南芥的鉴定及纯系的筛选

3．本章小结

总结

参考文献

致谢

作者简介

在校期间论文发表情况