东海原甲藻磷胁迫响应基因的分析及细胞死亡相关基因的克隆与分析

摘要

本文构建了对数生长期东海原甲藻的cDNA文库。使用mRNAPurification Kit MagExtractor -mRNA-提取纯化对数生长期东海原甲藻poly(A)<'+>RNA，使用Super SMART<'TM>PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒将poly(A)<'+> RNA逆转录为单链cDNA并进行PCR扩增，然后将cDNA连接到pMD 18-T vector载体上，并电转化至感受态细胞E coli JM109。结果显示，感受态细胞电转化转化效率大于10<'9>，并且，绝大部分插入片断大小在500-1500bp之间。使用此种方法，使我们能够对微量东海原甲藻细胞(细胞数小于10<'5>个细胞)构建cDNA文库。 以正常磷酸盐营养浓度培养条件下的东海原甲藻为对照组，使用cDNA-AFLP技术对磷胁迫下的东海原甲藻的表达情况进行了分析。通过AFLP分析，共分离了50条表达差异条带，最后到43条有效序列。网上BLAST分析结果显示，其中8条序列搜寻到匹配序列，而剩余的35条序列则未搜寻到匹配序列。以β-actin为参照基因，进一步对其中的三个基因片断进行了表达差异分析，结果表明，在受到磷酸盐胁迫时，这三个片断所代表基因的表达量全部有所增加，并且与对照相比，差异显著。其中，基因片段TDF72(antioxidant，AhpC/Tsa family)的表达量在磷胁迫时是对照组的1.24倍(p=0.04)；TDF68(dual-specificity protein phosphatase)是对照组的1.60倍(p=0.002)TDF85(Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mlatase)是对照组的2.30倍(p=0.0001)。通常认为，单细胞浮游藻是

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

东海原甲藻cDNA文库构建

前言

材料与方法

材料

Poly(A)+RNA的抽提

东海原甲藻cDNA的合成

东海原甲藻cDNA文库的构建

结果与讨论

小结

东海原甲藻磷胁迫响应基因研究

前言

材料与方法

材料

磷胁迫处理

总RNA的提取纯化

总RNA的电泳检测

双链cDNA的合成

cDNA PCR扩增

cDNA的AFLP分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

切胶、二次扩增

连接转化

重组子检测及测序

序列分析及引物设计

RT-PCR分析

逆转录

结果与讨论

小结

东海原甲藻细胞程序化死亡相关基因研究

前言

材料与方法

材料

Poly(A)+RNA提取

半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶全长cDNA序列的克隆

RT-PCR分析

结果与讨论

小结

结论

参考文献

附录

致谢